抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制品技术及应用领域，尤其是设及一种抗灿烂弧菌卵黄抗体及其 制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 灿烂弧菌（Vibriosplendi化S)是在海洋及盐湖环境中分布极为广泛的一种致病 性嗜盐细菌，隶属弧菌科中的弧菌属。灿烂弧菌是海水动物的重要致病菌，可引发刺参、大 菱解、牙解、大西洋娃鱼、縛鱼、驴鱼等水生动物的多种疾病。灿烂弧菌可引起刺参的"腐皮 综合征"，死亡率高达90% W上，给养殖业带来巨大损失。
[0003] 目前对于灿烂弧菌引起的疾病的防治手段主要有W下几种：抗生素和化学类药 物、中草药、灭活疫苗和抗体等。其中使用最为普遍的即是抗生素和化学类药物。但随着抗 生素和化学药物的长期滥用，带来了诸多弊端：①使病原菌产生耐药性，W致抗生素的作用 效果显著下降，甚至无效；②造成严重的水体污染，并引发水环境微生态失衡；③在动物体 内产生药物残留，影响产品的质量安全，并间接危害人体健康。因此，亟待寻求一种既能有 效控制海水养殖动物疾病，又不会带来毒副作用的新技术、新产品，W部分或完全替代现有 抗生素或化学药物，实现健康养殖，也已成为当前研究的热点和难点。 阳004] 卵黄抗体（eggyo化immunoglobulin，I巧）由于具有特异性强、高效性、无毒无副 作用及对环境无害等特点，已经成为一种有效地抗生素和化学类药物替代品。而且卵黄抗 体具有低成本、高效益，生产便利及产量高等特点，被作为疾病预防和控制的有效方法而受 到广泛的关注。与传统的抗生素和化学药物相比，应用卵黄抗体具有W下几个优点：（1)特 异性强。与广谱的抗生素不同，卵黄抗体只针对相应的致病菌，不会对其它菌群产生影响。 (2)易获取。卵黄抗体可从免疫蛋鸡的鸡蛋中获取，无需宰杀大量动物且产生的抗体效价 高，稳定性强，能够避免频繁注射。（3)于鸡类与哺乳动物间存在一定系统发育距离，少量 抗原就可W引发有效的免疫应答。（4)无残留。由于卵黄抗体属于免疫球蛋白，发挥作用 后会被机体作为营养物质消化吸收。（5)研制开发的周期短，成本低，可长期保存，便于运 输和应用。自1898年由Klemperer首次发现W来，已广泛应用于动物疾病的防治和疾病诊 断等方面。美国食品和药品管理局（抑A)将卵黄抗体列入"公认安全使用物质（Generally RecognizedAsSafe,GRA巧，把卵黄抗体看作药效营养品（Nutraceuticals)。特异性卵黄 抗体通过饲喂、注射和浸浴等方式，对水产动物起到保护预防及疾病治疗作用，还可W应用 于免疫学检测和疾病诊断等领域。目前，水产方面申请公开和授权的专利有抗对邮病毒病、 抗贝氏隐抱子虫病、抗副溶血弧菌病、抗嗜水气单胞菌病W及抗媛弧菌病的卵黄抗体，还没 有关于抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用的相关研究报道。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价 检测方法和应用。本发明的抗灿烂弧菌卵黄抗体特异性强、纯度高，且对灿烂弧菌有较强的 抑制作用，同时抗体制备成本低、方便简易，适于大规模生产，可用于由灿烂弧菌引起的疾 病的预防和治疗上W及开发灿烂弧菌检测试剂盒免疫学反应及诊断。
[0006] 本发明的第一方面提供一种抗灿烂弧菌卵黄抗体，该抗灿烂弧菌抗体是用灭活灿 烂弧菌为抗原对蛋鸡进行免疫，收集该被免疫的蛋鸡的鸡蛋，对鸡蛋卵黄中分离得到的水 溶性组分，再进行分离纯化后得到的。 阳007] 进一步地，所述的蛋鸡为20周龄的健康产蛋母鸡。
[0008] 本发明的第二方面，提供一种上述所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体的制备方法，该制 备方法包括如下步骤：
[0009] (1)抗原的制备：将灿烂弧菌在液体培养基中扩增培养至菌液浓度107^ 109c即/ mU收集菌体，用PBS稀释后甲醒灭活，得到灭活的灿烂弧菌抗原；
[0010] (2)免疫蛋鸡：将步骤（1)得到的灭活的灿烂弧菌抗原与弗式完全佐剂或弗式不 完全佐剂按照等体积混合，乳化，制成弗式完全佐剂疫苗或弗式不完全佐剂疫苗；对蛋鸡进 行免疫，共免疫=次，初免使用弗式完全佐剂疫苗，二免和=免使用弗式不完全佐剂疫苗；
[0011] (3)二免后每隔一周收集鸡蛋一次，将收集的鸡蛋，清洗、消毒后，收集卵黄液，卵 黄液中加入6倍体积的去离子水稀释，调pH至5. 0, -20°C冷冻过夜后，在4°C缓慢解冻，反 复冻融2次后，离心收集上清液，依次用0. 45ym和0. 22ym的微孔滤膜过滤，收集滤液， 得卵黄抗体粗提物；
[0012] (4)将步骤（3)所得卵黄抗体粗提物进一步纯化，得到抗灿烂弧菌卵黄抗体。
[0013] 在上述技术方案中，步骤（2)所述的对蛋鸡的免疫方法为：初免时使用的弗式完 全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡ImU其中左右胸肌各注射0.2~0. 4mU颈后部皮下 注射0. 2~0.6mL;初免2周后进行二免，弗式不完全佐剂疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡 1. 5mU其中左右胸肌和颈后部皮下各注射0. 5mL;二免2周后进行S免，弗式不完全佐剂 疫苗的总注射剂量为每只蛋鸡2血，其中左右胸肌各0. 5~0.8血，颈后部皮下注射0. 4~ ImLo
[0014] 在上述技术方案中，步骤（4)所述的卵黄抗体粗提物的纯化方法为：向卵黄抗体 粗提物中加入硫酸锭至饱和度为60%，充分揽拌均匀后4°C过夜，4°C下离屯、，将沉淀用去 离子水稀释至原体积，再加入硫酸钢至饱和度为14%，充分揽拌均匀后室溫过夜，室溫离 屯、，将沉淀用去离子水稀释至原体积，得到卵黄抗体提取液；卵黄抗体提取液用lOOkDa截 留量的超滤膜包进行超滤浓缩，超滤后的卵黄抗体提取液在-70°C条件下预冻化，然后在 真空度20化下，冷冻干燥，24h后得到纯化的抗灿烂弧菌卵黄抗体冻干粉。
[0015] 在上述技术方案中，步骤（3)中得到的卵黄抗体的粗提物（水溶性组分）先进行 卵黄抗体效价测定后，选取抗体效价在1:10000W上的卵黄抗体的粗提物，再经纯化得到 抗灿烂弧菌卵黄抗体。其中所述的卵黄抗体的效价测定方法采用酶联免疫吸附法，具体方 法为如下：用l〇9CFU/mL菌浓度的灿烂弧菌包被酶标板，每孔100y^4°C包被过夜后，洗 涂，加入含有1%牛血清白（l%〇BSA)蛋白的封闭液37°C水浴化，洗涂，然后每孔加入用含 有1%。BSA的结合物稀释液稀释的卵黄抗体粗体物100y以同时设置阴性对照和空白对照； 每孔加入结合物稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡抗体（IgG-HRP)100y以37°C 水浴比，反应结束后洗涂，每孔加入TMB显色液100y以室溫避光显色20min，加入H2SO4终 止液50yL用酶标仪检测0D4we3。?。孤值大于阴性对照平均值2. 1倍的最高稀释度为卵 黄抗体效价。
[0016] 本发明的第=方面，提供上述所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体在制备预防和治疗灿烂 弧菌引起的疾病的制剂中的应用。所述制剂优选为药物、保健品和饲料添加剂。具体为：将 上述的方法制备得到的抗灿烂弧菌卵黄抗体的粗提物或经纯化得到的灿烂弧菌卵黄抗体 纯品按一定比例与辅料配比，制成不同的制剂，包括液态制剂、颗粒制剂、膏剂、片剂或胶囊 制剂等，可用于制备预防和治疗灿烂弧菌感染的疾病的药物、保健品，W及水产养殖中防治 灿烂弧菌引起的疾病的药物或饲料添加剂。所述辅料及比例不予特别限定，可W采用本领 域常规添加剂或比例。
[0017] 本发明的第四方面，提供上述所述的抗灿烂弧菌卵黄抗体，在制备W灿烂弧菌为 抗原的亲和纯化试剂或W灿烂弧菌为抗原的免疫检测试剂中的应用。其中，所述W灿烂弧 菌为抗原的亲和纯化试剂中，本发明的抗灿烂弧菌卵黄抗体可W作为亲和配基，用于相应 抗原的亲和纯化；所述W灿烂弧菌为抗原的免疫检测试剂中的应用，具体包括酶联免疫吸 附法、免疫沉淀、免疫电镜、免疫印迹、抗体忍片、时间分辨巧光免疫分析和免疫细胞学等一 系列免疫诊断技术中的应用，用W检测相应的抗原。
[0018] 本发明公开了一种抗灿烂弧菌卵黄抗体及其制备方法、效价检测方法和应用。该 制备方法得到的卵黄抗体特异性高、纯度高，且对灿烂弧菌具有较强的抑制作用，同时抗体 的制备方法简易方便，成本低、适于大规模生产，最后获得的高产、高效、高纯的卵黄抗体可 用于由灿烂弧菌引起的疾病的预防和治疗上及开发灿烂弧菌检测试剂盒和免疫反应诊断。 该效价检测方法