大肠杆菌的快速检验试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细菌检测技术领域，具体涉及大肠杆菌的检测装置与方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。主要生活在大肠内。大肠杆菌是引发肠道疾病以及系统性疾病的主要病原菌。研究表明，饮用水、食品中大肠杆菌的数量，可作为其安全程度的重要指标。因此，大肠杆菌的检测具有重要研究意义。
[0003]传统大肠杆菌检测主要有两种方法，一种需要进过提取分离培养，细菌形态鉴定等步骤较为繁琐。然而，这种技术具有局限性，多种细菌并不具可供鉴定的形态学特征；细菌培养技术本身会引入很大的误差，重复性低。这种传统大肠杆菌检测试剂的种类繁多耗时较长，而且试剂大多放在各个试剂瓶内，取用较为麻烦而且还容易搞错试剂，不利于长期发展。另外一种，实时荧光定量PCR，可将细菌样品的特异性DNA进行扩增，同时进行荧光定量检测。但这种方法极易产生非特异性产物，从而形成假阳性结果。
[0004]本方案提出的大肠杆菌的16S rDNA基因鉴定手段可克服以上问题。该手段不需细菌培养，直接提取样品基因组，继而进行特异性基因扩增检测。所需时间只需数小时。本发明所用的16S rDNA基因片段异性强，能有效地作为目标大肠杆菌的鉴定标记，提高检测结果的准确性。本发明所用的PCR技术和电泳技术灵敏度高，电泳技术对PCR产物进行分离/纯化检测，从很大程度上排除假阳性的可能性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于，提供一种大肠杆菌的快速检验试剂盒，解决以上技术问题。
[0006]本发明的另一目的在于，提供一种大肠杆菌的快速检测方法，解决以上技术问题。
[0007]本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现:
[0008]—种大肠杆菌快速检验的试剂盒，包括试剂盒主体，其特征在于，所述试剂盒主体还设有至少三个相对独立的密封腔室，分别为装有预处理液的第一腔室，装有PCR反应液的第二腔室和装有电泳液的第三腔室；
[0009]所述预处理液是一用于溶解并分散大肠杆菌的处理液；所述PCR反应液是一用于对大肠杆菌的16S rDNA片段进行特异性的复制增殖的PCR反应液；所述电泳液是一用于将采用所述PCR反应液得到的DNA分子进行电泳检测的电泳液。
[0010]本发明通过预处理液能够免去提取分离培养等步骤，可以直接得到大肠杆菌基因组，节省了时间提高了效率。所述预处理液能破坏采集到的细菌的细胞壁和细胞膜，获得细菌细胞的内容物将细菌的DNA释放到溶液中的预处理液。PCR反应液提供反应引物，反应原材料，合成所需要的酶。
[0011]所述第一腔室设有第一管路，所述第二腔室设有第二管路，所述第一管路和第二管路设有至少一个第一交叉点，所述第一交叉点为所述预处理液和所述PCR反应液进行反应的第一反应点；所述第三腔室设有第三管路，所述第三管路与所述第二管路设有至少一个第二交叉点，所述第二交叉点为所述PCR反应液和所述电泳液进行反应的的第二反应点。确保第一腔室，第二腔室导通、第二腔室与第三腔室导通。
[0012]所述第一腔室设有第一管路，所述第二腔室设有第二管路，所述第一管路和第二管路设有至少一个第一交叉点，所述第一交叉点为所述预处理液和所述PCR反应液进行反应的第一反应点；所述第三腔室设有第三管路，所述第一反应点与所述第三管路设有至少一个第二交叉点。确保第一腔室，第二腔室导通，所述预处理液和所述PCR反应液在第一交叉点进行反应，第二交叉点与第三腔室导通，从而实现所述预处理液和所述PCR反应液反应后的反应液与电泳液在第二交叉点反应。
[0013]所述第一管路与所述第三管路设有至少一个第三交叉点。
[0014]确保第一腔室，第二腔室和第三腔室三者之间两两相互导通便于检测。
[0015]所述预处理液是磷酸缓冲盐溶液。
[0016]所述磷酸缓冲盐溶液主要成分以质量百分比，包括3 O %?4 5 %磷酸二氢钾、15%?25%磷酸氢二钠、25%?35%氯化钠、10%?13%氯化钾和10%?15%水。磷酸缓冲盐溶液具有盐平衡、可调整的适宜PH缓冲作用。
[0017]所述PCR反应液主要成分以容积计，包括3 μ L-1O μ L三羟甲基氨基甲烷缓冲液，2 μ L-8 μ L脱氧核糖核苷三磷酸，0.2 μ L_0.5 μ L DNA聚合酶和I μ L-2 μ L大肠杆菌细菌的特异性引物和35 μ L-40 μ L去离子水。三羟甲基氨基甲烷缓冲液用作核酸和蛋白质的溶剂，也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一。
[0018]所述大肠杆菌细菌的特异性引物的浓度在150nmol/L?250nmol/L之间。
[0019]所述脱氧核糖核苷三磷酸的浓度在2nmol/L?3nmol/L之间。
[0020]最适条件可进行梯度实验进行调整。
[0021]所述三羟甲基氨基甲烷缓冲液的PH值在7.8?8.4之间，优选为PH = 8。
[0022]弱碱环境下缓冲液发挥的功效最大。
[0023]所述电泳液是羟乙基纤维素溶液。对电介质具有异常好的盐溶性。
[0024]所述特异性引物序列为:
[0025]上游引物:5’ -GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3 ’
[0026]下游引物:3’-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-5’。用于对大肠杆菌细菌的 16SrDNA片段进行特异性的复制增殖。
[0027]所述试剂盒主体是由聚乙烯制成的试剂盒主体。聚乙烯质量轻硬度大，成本低，使用寿命长。
[0028]所述试剂盒主体保存的条件在-15摄氏度?-30摄氏度，优选为-20摄氏度。低温环境能保持试剂活性，减慢试剂降解的速度。
[0029]作为一种方案，所述试剂盒主体的体积不超过200 μ L0降低检测成本。
[0030]作为另一种方案，所述试剂盒单次使用各试剂的体积均在yL量级。
[0031]—种大肠杆菌的快速检测方法采用所述大肠杆菌快速检验的试剂盒进行检测。
[0032]—种大肠杆菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0033]步骤一，大肠杆菌待测样本液氮研磨，取0.05g?0.07g粉末，浸泡在所述预处理液中，使得样本中的大肠杆菌的内容物释放在溶液中；
[0034]步骤二，取步骤一所得到I μ L?20 μ L的溶液，添加到所述PCR反应液中，进行PCR反应，使大肠杆菌的16S rDNA片段进行特异性的复制增殖；
[0035]步骤三，取步骤二所得到的IyL?1yL溶液，使用所述电泳液进行毛细管电泳分离和检测，根据电泳检测到的DNA情况，得出大肠杆菌的阴、阳性。
[0036]本发明减少了多种试剂的使用，从而对检测大肠杆菌的效率进行进一步的提升，优化了检测步骤，减少了错误率。步骤三中若电泳检测到544bp的DNA，即表明样本中含有大肠杆菌，反之则没有。特异性强，灵敏度高。通过PCR反应和特异性引物，样本中对应于大肠杆菌的特异性DNA序列数量得到极大增加，其增殖倍数可达109，样本中的少量大肠杆菌细菌就可被检测到。而样本中其它来源的DNA数量则不会得到增加，不会干扰目标细菌的检验。速度快，效率高，每个PCR产物的电泳检出时间通常不超过8分钟。
[0037]所述步骤三中，若电泳检测到来自于大肠杆菌的544bp的特异性序列，即表明样本中有大肠杆菌，反之则没有。
[0038]所述步骤一中，浸泡时间不少于2分钟，优选为3分钟。使物质充分释放在溶液中。
[0039]所述步骤二中反应条件包括将大肠杆菌待测样品放置在常规PCR仪中，先预热5-10分钟，所述预热环境在90摄氏度?100摄氏度，然后在第一温度阶段和第二温度阶段中反复循环10-40次。确保尽可能检测到真实的数据。
[0040]所述第一温度阶段为持续10秒?15秒在95摄氏度?100摄氏度的环境中；所述第二温度阶段为持续30秒?40秒在55摄氏度?70摄氏度的环境中。对大肠杆菌进行特异性的PCR增殖。
[0041]作为一种优选方案，所述预处理液为100 μ L磷酸缓冲盐溶液，所述PCR反应液包括三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH = 8)5 μ L ;脱氧核糖核苷三磷酸0.2mM;DNA聚合酶0.25 μ L，大肠杆菌的特异性引物200ηΜ，上/下游引物各I μ L ;去离子水37.75 μ L ;共49 μ L ;大肠杆菌的特异性引物序列为:
[0042]上游引物:5’ -GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3 ’
[0043]下游引物:3’ -AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-5 ’ 电泳液:0.5 % 羟乙基纤维素(1300k)溶液，含 Ix SYBR Green I，共 50 μ L0
[0044]作为一种优选方案，大肠杆菌的检测方法包括:
[0045]步骤一，大肠杆菌待测样本液氮研磨，取0.05g?0.07g粉末，浸泡在所述预处理液中3分钟，使得样本中的大肠杆菌的内容物释放在溶液中；
[0046]步骤二，取步骤一所得到I μ L的溶液，添加到所述PCR反应液中，将PCR反应液置于PCR仪内，95°C (预热)2分钟，然后设置95°C (变性)10秒、64°C (退火和延伸)30秒两个温度阶段，循环40次，最后冷却至4摄氏度；
[0047]步骤三，取步骤二所得到的溶液置于样品位置，所述电泳液填充入毛细管，电场强度lOOV/cm进样2秒；然后以电场强度200V/cm电泳，采用荧光检测；若电泳检测到来自于大肠杆菌的544bp的特异性序列，即表明样本中有大肠杆菌，反之则没有。
【附图说明】
[0048]图1为本发明的荧光检测信号的一种示意图；
[0049]图2为本发明大肠杆菌的检测方法的流程图。
【具体实施方式】
[0050]为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。
[0051]参照图1、图2，一种大肠杆菌快速检验的试剂盒，包括试剂盒主体，试剂盒主体还设有至少三个相对独立的密封腔室，分别为装有预处理液的第一腔室，装有PCR反应液的第二腔室和装有电泳液的第三腔室；预处理液是一用于溶解并分散大肠杆菌的处理液；PCR反应液是一用于对大肠杆菌的16SrDNA片段进行特异性的复制增殖的PCR反应液；电泳液是一用于将采用PCR反应液得到的DNA分子进行电泳检测的电泳液。本发明通过预处理液能够