一种磁性全细胞催化剂及制备方法和生产生物柴油的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物和能源化工领域，特别是涉及一种磁性全细胞催化剂生产生物柴油的方法。
【背景技术】
[0002]作为一种清洁的可再生能源，生物柴油的发展具有广阔的市场前景。生物柴油的制备主要采用化学法，它具有工艺简单、操作费用低、制得的产品性质稳定等优点。但是，化学法存在以下缺点:反应温度较高、工艺复杂；能耗高；产品纯化复杂，酯化产物难于回收；副产物难于去除；容易产生废水，对环境造成二次污染等。
[0003]为解决化学法存在的上述问题，人们开始深入研究利用生物法制备生物柴油。一个很有前景的解决方法是利用全细胞生物催化剂来制备生物柴油。例如，中国专利CN103789364A公开了一种毕赤酵母全细胞催化制备生物柴油的方法，该方法以脂肪酶基因重组载体和酵母宿主为出发材料，利用酵母重组表达和高密度发酵，基于高效胞内表达脂肪酶制备重组毕赤酵母全细胞，同时结合通透性处理，将通透型酵母全细胞应用于生物柴油催化，制备高得率的生物柴油。中国专利CN102367459A公开了一种米根霉全细胞催化蚕蛹油制备生物柴油的方法，该方法将培养的米根霉发酵混合液减压抽滤，再将得到的米根霉菌丝体再冷冻干燥8-12h，然后直接把米根霉菌丝体加入到蚕蛹油、甲醇、乙酸钠缓冲液中反应，制备生物柴油。但是，这些利用全细胞催化剂制备生物柴油的方法，其操作过程比较复杂，细胞没有固定化，所以全细胞催化剂在生物柴油制备反应体系中，难于分离。
[0004]中国专利CN102952754A公开了一种利用固定化细胞制备生物柴油的方法，该方法分两步，先制备出多孔多胺化壳聚糖微球载体，再将自制的具有高脂肪酶活力单位的微生物菌种，固定在此微球载体上，然后催化废弃餐饮油制备出生物柴油，该方法操作复杂，。中国专利CN103421716A公开了一种磁性全细胞催化剂的制备方法，也分两步，先制备出磁性壳聚糖微球，然后再把产脂肪菌固定在微球载体上，制备过程比较复杂，而且凝结液使用质量百分数为20%的NaOH水溶液和体积百分数为30%的甲醛水溶液，高浓度的NaOH水溶液对容器腐蚀很严重，甲醛有毒，造成环境污染，安全性低。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种稳定性好、安全性高、易于回收的并且可以重复利用的磁性全细胞催化剂。
[0006]本发明的第二个目的是提供一种磁性全细胞催化剂的制备方法。
[0007]本发明的第三个目的是提供一种磁性全细胞催化剂生产生物柴油的方法。
[0008]本发明的技术方案概述如下:
[0009]—种磁性全细胞催化剂的制备方法，包括如下步骤:
[0010](I)将门多萨假单胞菌接种到100-150mL LB培养基中，28_35°C、140_160r/min培养20-30h，在7000-10000r/min离心10_15min，弃去上清液，收集门多萨假单胞菌细胞；
[0011](2)按比例，取0.5-1.5g S12-Fe3O4纳米颗粒，加入到50-100mL质量百分比为2.5%-3.5%的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，再加入步骤(I)获得的菌细胞，混匀后得到混合液；所述海藻酸钠溶液的溶剂为0.5-1.5M氢氧化钠水溶液；
[0012](3)将步骤⑵获得的混合液逐滴滴入搅拌条件下的150-200mL l_2mol/L无菌CaCl2水溶液中，所述搅拌的速率为200-400r/min，待混合液滴加完成后，静置1.5_3h，用磁铁吸出磁性微球，并用灭菌水反复清洗至中性，即获得磁性全细胞催化剂。
[0013]门多萨假单胞菌优选保藏号为CGMCC N0.7644的门多萨假单胞菌Pseudomonasmendocina0
[0014]混合液逐滴滴入所使用设备滴头的内径优选1.19-1.54mm。
[0015]混合液逐滴滴入所使用注射器针头的内径优选1.19-1.54_。
[0016]上述方法制备的磁性全细胞催化剂。
[0017]用上述磁性全细胞催化剂生产生物柴油的方法，包括如下步骤:
[0018]按比例，取30-50粒磁性全细胞催化剂，加入到10-15mL油脂和l_2mL甲醇中，在28-350C、140-160r/min条件下反应，每隔10_12h加入l_2mL甲醇，反应2-3天，用磁铁吸出反应后的磁性全细胞催化剂，剩余液体离心后取上清液过滤，得到含有生物柴油的滤液。
[0019]油脂可以选自棕榈油、豆油、油菜籽油、棉籽油、玉米油、葵花籽油、麻疯树油、工业猪油、牛油、鱼油、地沟油和藻油中至少一种。
[0020]本发明的优点:
[0021]1.本发明的一种磁性全细胞催化剂的制备方法，为一步法，操作简单，避免了传统两步法生产中先制备载体后固定细胞的繁琐过程。而且一步法是在制备固定化载体的过程中，直接添加细胞，提高了细胞的负载量，并且可使制备出的磁性全细胞催化剂中的细胞均匀分布在颗粒的内部和表面，在生产生物柴油时内部细胞可以缓慢释放，提高了全细胞催化剂的催化能力和重复利用性。
[0022]2.本发明的一种磁性全细胞催化剂的制备方法，制备过程中涉及到的化学试剂对反应设备的腐蚀相对较小，安全性高，条件温和，而且对环境的污染也相对较小。
[0023]3.本发明的一种磁性全细胞催化剂的制备方法，制备过程中Fe3O4表面包覆的一层生物相容性高的S12，可使S12-Fe3O4与海藻酸钠连接更紧密，提高了磁性全细胞催化剂的成球性和稳定性，使多次重复利用后仍不破碎。而且S12*可使制备出的磁性全细胞催化剂磁性更强更持久，在生产生物柴油时更有利于分离。
[0024]4.本发明的一种磁性全细胞催化剂的制备方法，制备出的磁性全细胞催化剂，颗粒直径在2-6_，生物活性高而且在生物柴油制备反应体系中，磁性全细胞催化剂可以直接用磁铁分离吸出，由于细胞分布在颗粒的内部和表面，在多次循环使用后磁性全细胞催化剂的活性仍很高，用磁性全细胞催化剂生产生物柴油的方法降低了生物柴油生产工艺的难度，操作简单、条件温和、适用性强、安全性高、适合批量生产。
【附图说明】
[0025]图1为实施例1制备的磁性全细胞催化剂。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。下面的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
[0027]本发明各实施例所使用的S12-Fe3O4纳米颗粒采用中国专利申请号为201510312626.0的方法制备。
[0028]各实施例所使用的门多萨假单胞菌均为保藏号为CGMCC N0.7644的门多萨假单胞菌 Pseudomonas mendocina。
[0029]门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC N0.7644，保藏日期为2013年5月27日，建议分类命名为门多萨假单胞菌 Pseudomonas mendocina。
[0030]实施例1
[0031]—种磁性全细胞催化剂的制备方法，包括如下步骤:
[0032](I)将保藏号为CGMCC N0.7644的门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina (以下简称门多萨假单胞菌)接种到10mL LB培养基中，35°C、160r/min培养20h，在9000r/min离心12min，弃去上清液，收集门多萨假单胞菌细胞；
[0033](2)按比例，取Ig S12-Fe3O4纳米颗粒，加入到70mL质量百分比为3%的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀后，再加入步骤(I)获得的菌细胞，混匀后得到混合液；所述海藻酸钠溶液的溶剂为IM氢氧化钠水溶液；
[0034](3)将步骤(2)获得的混合液用配有内径为1.36mm针头的注射器逐滴滴入搅拌条件下的150mL 1.5mol/L无菌CaCl2水