来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种来源于副溶血弧菌隧菌体的内溶素及其 应用。
【背景技术】
[0002] 副溶血性弧菌是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌，为二级有害微生物，隶属 弧菌科中的弧菌属，它是一种人畜共患病菌，广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物W及鱼 类、贝类等海产品之中。随着抗生素的大量和长期使用，在食品和环境中，日趋严重的耐药 型副溶血弧菌已影响人类感染副溶血弧菌疾病的治疗，能否研究出新型的生物抑菌剂来替 代化学抗生素是目前科研人员面临的一个挑战。
[0003]隧菌体内溶素是一类能够裂解细菌细胞壁的裂解酶。尽管在1957年隧菌体内溶 素裂解细菌的能力就被首次报道，但直到2001年化Ison等才证实纯化的重组内溶素可W 作为抗菌剂有效控制大鼠感染A族链球菌。到目前为止，内溶素已被用来防控和检测食品 中的食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌和梭状芽抱杆菌。与使用小分子抗生素用 于抗菌治疗或预防相比，专一性的内溶素不易导致抗性菌株的快速出现。在细菌耐药性日 益严重的现在，尤其在市场对新型抗菌剂的需求空前提高，内溶素不易产生抗性且裂解专 一性的特点，使其作为新型抗菌剂具有一定的优势。
[0004]虽然国内利用基因工程技术构建内溶素生产菌株的工作已经有了一定的进展，但 是在研究和生产过程中存在的重要的问题是，制备的内溶素大多数都集中在革兰氏阳性细 菌的防治和检测，对于革兰氏阴性细菌尤其是副溶血弧菌的防控研究仍较少。所W，针对副 溶血弧菌的耐药性日趋严重及相关内溶素缺乏的问题，本发明开发出能够高效裂解副溶血 弧菌的内溶素或内溶素基因。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种来自副溶血弧菌隧菌体的具有显著抑菌效果的内溶素。
[0006] 本发明还提供所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。
[0007] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0008] 一种具有环境消毒能力的隧菌体，该隧菌体单体为副溶血弧菌隧菌体，拉下名为 Vibriopar址aemolyticus地age,被命名为qdvpOOl，保藏编号：CCTCCN0:M2011143,保藏 日期为2011年4月26日。该副溶血弧菌隧菌体qdvpOOl为烈性隧菌体，具有裂解副溶血 弧菌的功能。
[0009] 该隧菌体对副溶血弧菌具有强烈的裂解作用，为工业化生产隧菌体及用于消毒杀 菌提供了隧菌体来源。
[0010] 一种来源于上述副溶血弧菌隧菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQIDNo:1所示 的全部或部分氨基酸序列。经过序列结构分析，显示该酶为隧菌体中的能够裂解细菌细胞 壁的裂解酶，经试验证实，该氨基酸序列形成的蛋白具有较好的杀菌活性。
[0011] 编码所述的内溶素的基因，所述基因的核巧酸序列如SEQIDNo:2所示。
[0012] 含有所述的基因的表达载体、工程菌或细胞系。
[0013] 所述原核细胞表达载体为祀T-30a(+)。
[0014] 所述工程菌为大肠杆菌Rosseta(DE3)。
[0015] 一种所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。目前尚未有文献公开过副溶血弧菌隧 菌体qdvpOOl能够产生裂解副溶血弧菌细胞壁的裂解酶，而本发明的内溶素具有该功能， 对副溶血弧菌具有有效的杀菌活性。
[0016] 本发明的有益效果是：本发明的内溶素通过市场上已有的适合表达载体表达、纯 化后，体外对副溶血弧菌表现出显著的杀菌效果，可用于副溶血弧菌抑菌剂的制备。
【附图说明】
[0017] 图1为内溶素蛋白进行结构域分析预测图； 阳018] 图2为内溶素蛋白在大肠杆菌中高效表达图谱，M为marker，！为未经IPTG诱导 的细菌总蛋白，2、3、4、5过柱过程中收集的洗脱液，6为儀柱纯化后的融合蛋白，7为超滤浓 缩脱盐后的融合蛋白，8为经过诱导的细菌总蛋白；
[0019] 图3为内溶素蛋白裂解副溶血弧菌ATCC17802的吸光值变化图谱；
[0020] 图4为内溶素蛋白裂解副溶血弧菌ATCC17802的浊度变化图谱。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本发明保护范围。
[0022] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常 规方法。
[0023] 本发明试验设及的菌株：副溶血弧菌VP17802(保藏号为ATCC17802)，购买于美 国ATCC中屯、，副溶血弧菌VIB304、副溶血弧菌VIB461、副溶血弧菌VIB800和副溶血弧菌 VP14-90、VP1. 2、VP2. 1、VP3. 2、VP4. 1均保存在中国海洋大学食品安全实验室。
[0024] 本发明设及的副溶血弧菌隧菌体，该隧菌体qdvpOOl保存于中国典型培养物保 藏中屯、，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2011143,保藏日期为2011年 4月26日，分类学命名：副溶血弧菌隧菌体qdvpOOl(Vibriopar址aemolyticusphage qdvpOOl)〇
[00巧]2216E培养基，青岛海博生物技术有限责任公司； 阳0%] LB液体培养基，北京陆桥技术有限责任公司；
[0027] 质粒祀T30a和大肠杆菌Rosetta(DE3)，北京康为世纪公司；
[0028]NiSe地aroseTM6化StFlow填料，美国GE公司；
[0029]异丙基-P-D-硫代半乳糖巧（IPTG)，北京索莱宝科技有限公司。
[0030] 实施例1 :内溶素蛋白功能预测
[0031] 本发明人从污水中分离出一株副溶血弧菌的烈性隧菌体qdvpOOl。经全基因组测 序和分析，鉴定该隧菌体0RF60编码的蛋白在氨基酸序列上与弧菌隧菌体ICPl基板和尾 部水解酶有56%的相似度。使用SMART软件对0RF60编码的蛋白LysqdvpOOl进行结构 域预测分析。结构域预测结果如图1所示，LysqdvpOOl的9-65氨基酸区间为高度保守功 能区域，属于PG_binding(PF01471)域，该家族与细胞壁肤聚糖结合有关。LysqdvpOOl的 123-216氨基酸区间为高度保守的功能区域，属于CHAP家族（PF05257)，该家族与原核细胞 细胞壁肤聚糖水解有关。
[0032] 实施例2 :内溶素在大肠杆菌中的高效表达
[0033] 1、重组质粒的构建
[0034] 根据内溶素基因序列（SEQIDNo:2)，设计引物，上游引物：CGGGATCCATGA