用于构建单细胞转录组测序文库的试剂盒及文库构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域,具体设及单细胞转录组测序文库的构建方法、单细 胞转录组测序方法及用于构建单细胞转录组测序文库的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 全基因组范围内的转录组分析被广泛应用,早期的方法是从大量的组织样品中获 取RNA进行测序。但此传统方法依赖于一次性总体分析数百万个细胞的基因表达,往往会 掩盖特异组织中某些特化细胞具有生物学意义的基因表达差异。并且,在健康组织或肿瘤 等病变组织中,某些细胞的数量稀少,除了单细胞方法没有任何其他的技术能够对它们进 行分析。
[0003] 单细胞基因表达分析则克服了运些局限,可用于在全基因组范围内挖掘基因调节 网络,尤其适用于存在高度异质性的干细胞及胚胎发育早期的细胞群体。与活细胞成像系 统相结合,单细胞转录组分析更有助于深入理解细胞分化、细胞重编程及转分化等过程及 相关的基因调节网络。将此技术应用于临床,理论上可W在生理或病理情况下连续追踪基 因表达的动力学变化,从而监测疾病的进展。单细胞转录组分析的另一应用领域是发现亚 细胞成分的基因表达谱,例如对在神经元的轴突或树突部分特异表达的基因的转录组的分 析,运些基因往往对细胞的生物学功能发挥着重要作用。
[0004] 1990年,NormanIscove的课题组首次证实对单细胞进行转录组分析是可行的,他 们用PCR技术实现了对cDNA分子的指数级扩增。在20世纪90年代初期,Eberwine等人 发明了一种新技术,能够从单个的活神经元细胞中获得cDNA,并且再W运些cDNA为模板 转录生成RNA,实现RNA的线性扩增。随着忍片时代的来临,科学家们用运些线性、和指数级 扩增技术对单细胞之间的基因表达差异进行了大量的比较和研究。
[000引 2008年时出现了高通量RNA测序技术,不久之后,运种技术与前面发展起来的 核酸扩增技术结合起来,对单细胞转录组进行了更加精细的研究。2009年,英国剑桥大 学Gurdon研究所Tang通过对单个小鼠卵裂细胞化lastomere)的研究发现,与忍片技术 相比,利用单细胞转录组技术可W多发现数千个基因的表达情况(化t.Methods6,377 -382, 2009)。原本用于单细胞忍片研究的流程被用于单细胞mRNA-Seq测序,但是从单细胞中 很难得到较好的数据,不能区分生物本身的差异还是由于由低起始量的RNA造成的技术上 的差异;而且mRNA-Seq方法优先扩增mRNA的3'端,不能产生全转录组的覆盖度。
[0006] 2012年,Illumina公司联合San化erg实验室开发出了用于此类分析的领先技术: Smart-seq。运一新方法提高了转录本的覆盖水平,有较高的灵敏度和定量的准确性,增强 了可变转录异构体的分析和分辨SNP现象的能力。虽然用单细胞测定估计的表达量有些误 差,但是用较少的细胞可W鉴定出来许多不同表达的基因。
[0007] 2013年Sandberg实验室于化1:ureMethods发表Sma;rt-seq2方法(非专利文 南犬1:SimonePicelli,RickardSandberg,etal.Smart-seq2forsensitivefull-length transcriptomeprofilinginsinglecells.naturemethods, 20ISSeptember,d oi: 10. 1038Aimeth. 2639.),此改良技术比Smart-seq产生平均更长的cDNA分子和更高的 产量。Smart-seq2转录组文库提高发现能力,增加了覆盖度并且有更低的技术偏差。并且 Smart-seq2完全可W采用现有的通用试剂,而非商业化试剂盒,可W很划算地构建测序文 库。
[0008] Sma;rt-seq2方法使用带有固定序列的oligo-dT、TS0、ISPCR引物进行逆转录扩 增,能够有效提高cDNA的扩增效率。但,在采用例如Illumina高通量测序仪进行测序时, 从采用该方法构建的高通量测序文库中获取的有效数据的比例偏低,运会给后续的数据分 析带来不利影响。
【发明内容】
[0009] 鉴于上述现有技术中存在的不足,本发明的目的在于提供一种能够显著提高有效 数据比例(CleanReadsRate)的单细胞转录组测序文库的构建方法及单细胞转录组测序 方法。
[0010] 本发明的发明人为解决上述技术问题进行了深入研究,结果发现:通过在传统的 单细胞转录组测序文库构建方法的基础上进行巧妙的改进,即可显著地提高有效数据比 例,从而完成了本发明。 W11]旨P,本发明包括:
[0012] 1. 一种单细胞转录组测序文库的构建方法,其包括:
[0013] 步骤A:采用Sma;rt-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增,得到cDNA;
[0014] 步骤B:W所述cDNA作为希望进行测序的DM片段,构建测序用DM片段文库;
[0015] 步骤C:将所述测序用DNA片段文库用Rsal限制性内切酶进行酶切,得到酶切产 物;化及
[0016] 步骤D:将所述酶切产物进行PCR扩增,得到单细胞转录组测序文库。
[0017] 2.根据项1所述的单细胞转录组测序文库的构建方法,其中,所述步骤B包括:
[0018] 步骤B-1:将所述cDNA片段化,得到片段化的cDNA;
[0019] 步骤B-2:对所述片段化的cDNA进行末端修复,得到平末端DM片段; W20] 步骤B-3 :将所述平末端DNA片段进行3'端加A,得到3'端加A的DNA片段;[OOW步骤B-4 :将所述3'端加A的DM片段进行加接头,得到加接头DM片段;W及
[0022] 步骤B-5 :将所述加接头DNA片段进行PCR扩增,得到扩增产物。
[0023] 3.根据项2所述的单细胞转录组测序文库的构建方法,其中,所述步骤B还包括:
[0024] 在所述步骤B-5之后进行的步骤B-6 :从所述扩增产物中纯化回收具有目的大小 的片段。
[00巧]4.根据项2所述的单细胞转录组测序文库的构建方法,其中,在所述步骤B-1与所 述步骤B-2之间、所述步骤B-2与所述步骤B-3之间、所述步骤B-3与所述步骤B-4之间、 所述步骤B-4与所述步骤B-5之间、和/或所述步骤B-5之后,还包括纯化步骤。
[00%] 5.根据项1所述的单细胞转录组测序文库的构建方法,其中,在所述步骤A与所述 步骤B之间、所述步骤C与所述步骤D之间、和/或所述步骤D的PCR扩增之后,还包括纯 化步骤。
[0027] 6.-种单细胞转录组测序方法,其包括:
[0028] 采用项1~5中任一项所述的单细胞转录组测序文库的构建方法构建单细胞转录 组测序文库;W及
[0029]W所述单细胞转录组测序文库作为对象进行测序。
[0030] 7.根据项6所述的单细胞转录组测序方法,其中,所述测序为双端测序。
[00川 8.根据项6或7所述的单细胞转录组测序方法,其中,所述测序利用Illumina平 台进行。
[0032] 9. 一种用于采用项1的方法构建单细胞转录组测序文库的试剂盒,其包括:
[0033] 用于采用Smart-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增的试剂,
[0034] 用于构建测序用DNA片段文库的试剂, 阳03引 Rsal限制性内切酶,W及
[0036] 用于对所述Rsal限制性内切酶的酶切产物进行PCR扩增的试剂。
[0037] 发明效果
[0038] 根据本发明,通过将前期构建的测序用DNA片段文库用Rsal限制性内切酶进行酶 切,并对酶切产物进行PCR扩增,能够显著提高对单细胞转录组测序文库进行测序时的有 效数据比例。
[0039] 发明的【具体实施方式】
[0040] 本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义, 如有冲突W本说明书中的定义为准。
[0041] 在本说明书中,有效数据比例是指:经过数据过滤,除去不合格reads之后剩余的 reads为有效数据,其占总reads的比例即为有效数据比例(cleanreadsrate)。
[0042] 首先,在一个方面中,本发明提供一种单细胞转录组测序文库的构建方法(本发 明的文库构建方法),其包括:
[0043] 步骤A:采用Smart-Seq2方法对单细胞转录组进行扩增,得到cDNA;
[0044] 步骤B:W所述cDNA作为希望进行测序的DM片段,构建测序用DM片段文库;
[0045] 步骤C:将所述测序用DNA片段文库用Rsal限制性内切酶进行酶切,得到酶切产 物