水稻转化事件g6h1及其特异性pcr鉴定方法
【专利说明】水稻转化事件G6H1及其特异性PCR鉴定方法 (-)技术领域
[0001] 本发明设及一种水稻转化事件及其特异性鉴定方法，特别设及一种水稻转化事件 G6H1及其特异性PCR检测方法。 (二）【背景技术】
[0002] 水稻是一种重要的粮食作物。随着植物基因工程的发展，通过导入外源基因来进 行遗传改造成为遗传育种的主要手段之一。在水稻生产中，抗虫和抗除草剂都是非常需要 的农艺性状。抗虫转基因水稻能够大幅度地降低化学杀虫剂的使用量，从而降低生产成本 并且减少农药对环境和农作物产品的污染。
[0003] 抗草甘麟水稻可W大幅度降低防治杂草所需要的农业劳动力，降低劳动力的投 入，减少杂草对水稻生长发育的影响。近年来水稻栽培方法的变化使杂草问题变得严重，目 前已经成为水稻生产中的重要问题。特别是直播稻和免耕法的推广使杂草有了相当好的发 芽和繁殖机会，在很多地区已经造成杂草的严重发生。免耕法使杂草种子、杂草稻、野生稻 种子在大田中的成活能力得到提高。尽管选择性除草剂的使用能够部分地解决杂草问题， 但是杂草问题仍然没有得到根本性的解决。例如南方沿海地区的杂草稻和野生稻和栽培水 稻非常相似，市场上仍然没有良好的除草剂选择性杀灭杂草稻。因此抗草甘麟转基因水稻 的应用可W使稻田杂草防治变得更为简单、高效和低成本。
[0004] 利用外源基因转化植物时，因为外源基因在染色体上随机插入，往往得到的是一 个转化体群体。通常把外源基因在基因组插入位点的侧翼区序列不同的转化子称为独立转 化事件。转化体群体中包含大量独立的转化事件，其中每个事件都是独特的。外源基因在 植物中的表达受到外源基因所插入的染色体位置的影响。运可能源自染色质结构或者整合 位点附近转录调控元件的影响。因此相同基因在不同转化事件中的表达水平具有很大的差 异，在表达的空间或时间模式上也可能存在差异，而且外源基因的插入还可能影响内源基 因的表达。因此，每个独立转化事件对受体植物的影响都是不同的。目前并不清楚外源基因 在植物中的插入位点整合规律，在研发过程中需要产生数百乃至数千的不同转化事件，并 从中筛选具有预期转基因表达水平和模式，且不影响植株本身农艺性状的独立转化事件。 在抗虫抗草甘麟转基因水稻培育中，获得优良的独立转化事件在生产应用上具有重要的价 值。 (H)
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种优良的水稻转化事件G6H1，该转化事件可实现将外源基因 引入到水稻品种中，赋予受体水稻具有抗虫抗草甘麟的能力；抗虫抗草甘麟基因在受体水 稻中能够稳定遗传；抗虫抗草甘麟基因的表达对受体水稻的农艺性状不会产生不良影响。
[0006] 本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供一种在水稻基因组特定位点中单拷贝插入外源基因序列的水稻转化 事件G6H1，所述转化事件WSEQIDNO. 1所示的核巧酸序列为外源基因的左侧翼区，WSEQ IDNO. 3所示的核巧酸序列为外源基因的右侧翼区。本发明所述转化事件是利用农杆菌侵 染法，将含有抗虫抗草甘麟基因表达框的T-DNA导入水稻细胞中，通过再生含有外源基因 的水稻细胞获得水稻转基因群体。利用分子生物学方法筛选抗虫基因和抗草甘麟基因表达 量都高的转化株系，并通过生物测定的方法筛选抗虫性能和抗草甘麟性能都能够满足生产 需要的转化事件，从而获得具有良好抗虫性能和高抗草甘麟能力的水稻转化事件G6H1。
[0008] 进一步，所述外源基因包括抗虫基因和抗草甘麟基因，所述抗虫基因由二个化 基因组成，优选抗虫基因由基因化ylAb和基因Vip3H融合而成，核巧酸序列为SEQID ^.4中的2268-656669部分，优选所述抗草甘麟基因的核巧酸序列为56〇10^.4中 8787-10323bp部分。
[0009] 进一步，优选本发明所述外源基因的核巧酸序列为SEQIDNO. 2所示。
[0010] 本发明还提供一种含水稻转化事件G6化的水稻细胞，构建含有SEQIDNO. 2所示 核巧酸序列的T-DNA载体，然后通过农杆菌侵染法将T-DNA导入水稻细胞，筛选获得含有水 稻转化事件G6H1的水稻细胞。本发明构建的含有水稻转化事件G6H1的水稻细胞的受体水 稻具有抗虫抗草甘麟能力，特别赋予受体水稻具有抗稻纵卷叶惧抗草甘麟能力。
[0011] 本发明提供的转化事件G6化是由插入T-DNA左臂侧翼的水稻基因组序列SEQID NO. 1、外源基因T-DNA序列（不包括载体框架，左边界含部分pZmUbi-1序列）SEQIDNO. 2 和插入T-DNA右臂侧翼的水稻基因组序列SEQIDNO. 3构成，其核巧酸序列为SEQIDNO. 7。 该转化事件通过遗传转化方法获得。在遗传转化过程中，外源基因核巧酸被随机地整合在 植物基因组中，获得的转化事件是独特的而且能够稳定遗传。运种转化事件可W通过有性 杂交或体细胞杂交技术重组到不同的水稻种质资源中去，实现对水稻的改良。本领域的技 术人员可W理解，通过天然或人工的方式，在所述转化事件的基础上通过插入、缺失、取代、 替换、添加一个或多个碱基获得功能等同的亚结构，也属于本发明的范围之内。
[0012]本发明提供的转化事件G6H1含有能赋予转基因水稻具有抗虫抗草甘麟能力的抗 虫表达框和抗草甘麟表达框。
[0013] 本发明提供的抗虫基因是由crylAb和Vip3H基因融合获得，融合基因全长为 4299bp，核巧酸序列为载体序列（SEQIDNO. 4)中的2268-656化P，所编码的蛋白质由1433 个氨基酸残基组成，蛋白分子量大小约为159kDa。编码的氨基酸序列为SEQIDNO. 5。 化ylAb是一种杀虫能力比较强的化晶体杀虫蛋白质，Vip3类杀虫蛋白质和目前已经商业 化种植抗虫植物杀虫蛋白质的杀虫机理是不同，因此其融合蛋白具有提高杀虫活性，延缓 害虫交互抗性的产生，有利于抗虫转基因水稻的长期有效利用。
[0014] 本发明提供了一种抗虫表达框，该表达框由玉米polyubiquitin-1基因启动子 (pZmUbi-1)、抗虫融合基因crylAb-Vip3和玉米阳Pcarbo巧lase基因（P巧C)终止子构 成。其中玉米polyubiquitin-1基因启动子（pZmUbi-1)大小为2.化b，核巧酸序列为载体 序列（SEQIDN0.4)中的204-2263bp，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中 表达。PEPcarbo巧lase基因（P巧C)终止子，来源于玉米，大小为0. 2化，核巧酸序列为载 体序列（SEQIDNO. 4)中的 6570-676化P。
[0015] 本发明提供的抗草甘麟基因是5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合成酶（EPSP巧基因。 草甘麟是一种广谱灭生性除草剂，它通过抑制植物中5-締醇丙酬莽草酸-3-憐酸合成酶的 活性，导致植物不能合成芳香族氨基酸而死亡。为了方便杂草控制，通过在作物转入对草甘 麟具有抗性的EPSPS可W使作物获得抗草甘麟的能力，实现在农作物生长的同时选择性地 除草。本发明提供的抗草甘麟表达框是由玉米polyubiquitin-1基因启动子（pZmUbi-1)， 5'端连有一段编码AHAS基因叶绿体信号肤的G170巧PSPS)(核巧酸序列为载体序列（SEQ IDNO. 4)中8795-10323bp，编码的氨基酸序列为沈QIDNO. 6)和阳Pcarbo巧lase基因 (P巧C)终止子（载体序列沈QIDNO. 4中10327-1051化P)构成。
[0016] 本发明提供能够特异性检测样品中是否含有转化事件G6H1存在的方法，包括如 下方法中的至少一种：
[0017] 1)根据沈QIDNO. 7(即沈QIDNO. 1、沈QIDNO. 2 和沈QIDNO. 3 的联合） 设计特异性PCR检测引物，如用于检测外源基因左侧是否与水稻基因组特异性位点连接的 LB-SP4和RiceG8-R，用于检测外源基因右侧是否与水稻基因组特异性位点连接的特异性 引物RB-SP和化ceG8-GB。
[0018] 左侧翼检测引物：
[0019]RiceG8-R(5'TCGATCTGCTGCAGCTTGGTGCCGG，水稻基因组中）；
[0020] LB-SP4 巧 'TGGTTGGTGTCCGTTAGACTCGTCGA，T-DNA左边界）；
[00川PCR产物的长度计算为：188bp。
[002引右侧翼检测引物：
[0023]化ceG8-GB: (5,TATAAGTGTTCCCTCCCCTGTTTCAAC，水稻基因组中）；
[0024]RB-SP: (5'CGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGA，T-DNA右边界）；
[002引 PCR产物的长度计算为：468bp。
[0026] 本发明所述PCR反应体系为：
[0027] 10X扩増缓冲液 5|XL dNTF混合物200nmol/L正向引物 lOpmol 反向引物 10pmol 基因组DNA0.1~2H装 TaqDNA聚合酶 2.5,iiL MgCl： 1.5mm扫1法 加双蒸水至洗枯。
[002引 PCR反应条件为：32个循环，每个循环是95°C，45秒；65°C，50秒；72°C，30秒。
[0029] 2)提取植物基因组DNA经限制性内切酶化nl单酶切；W地高辛标记的抗草甘麟 基因G170(SEQIDN0.4中8787-10323bp)基因全长DNA作为探针，检测抗草甘麟基因是否 存在。
[0030] 或提取植物基因组DNA经过限制性内切酶Smal单酶切，地高辛标记的crylAb全 长DNA作为探针（SEQIDNO. 4中的2268-4220bp)，杂交到尼龙基质膜上W后巧光显影，检 测抗虫基因是否存在。DNA提取、探针制作方法和Southern杂交方法依据J.萨姆布鲁克 《分子克隆实验指南》。
[0031] 3)从植物中提取蛋白质，用抗虫蛋白或抗草甘麟蛋白抗体为一抗，进行Western 分析，检测抗虫蛋白或抗草甘麟蛋白的表达水平。蛋白提取方法、Western方法遵照J.萨 姆布鲁克《分子克隆实验指南》的方法。
[0032] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种优良的水稻转 化事件G6H1，该转化事件可实现将外源基因特异性引入到水稻品种中，赋予受体水稻具有 抗虫抗草甘麟的能力；抗虫抗草甘麟基因在受体水稻中能够稳定遗传；抗虫抗草甘麟基因 的表达对受体水稻的农艺性状不会产生不良影响。 (四）
【附图说明】
[003引图1、实施例1中含目的基因的质粒结构图，LB和RB:T-DNA的边界序列；pZmUbi-1 :玉米polyubiqutin-1 启动子；G170-AHAS:抗草甘麟EPSPS基因；CrylAb/Vip3H: 抗虫化融合基因crylAb/Vip3H。
[0034] 图2、抗虫抗草甘麟水稻基因组Southern杂交后的巧光显影图；基因组经Smal单 酶切；W地高辛标记的化ylAb的DNA作为探针杂交到尼龙基质膜上W后巧光显影；图右侧 为DNA长度标准化P)标记。
[0035] 图3、抗虫抗草甘麟水稻基因组Southern杂交后巧光显影图；基因组DNA经过 化nl酶切，地高辛标记的G170全长DNA作为探针，杂交到尼龙基质膜上W后巧光显影，图右 侧为DNA长度标准化P)。
[0036] 图4、Western分析抗虫蛋白质化ylAb/Vip3H在不同组织器官中的表达水平；+为 阳性对照；-为阴性对照（非转基因水稻）；M为蛋白质分子量标准（kD);材料：G細1，叶片、 茎、根的上样量是相同的鲜重，种子是W20%的量上样；箭头指杀虫蛋白质的信号带。
[0037] 图5、Western分析抗草甘麟