一种控制合成多产物的α-松油醇合酶基因的cDNA的制作方法
【技术领域】[0001] 本发明属于植物分子生物学领域，设及首次从红花香雪兰花瓣分离编码a-松油醇合 酶（a-te巧ineol)基因的cDNA和制备a-松油醇合酶蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 植物的花香是植物一个复合特性，它由一系列挥发性小分子化合物混合形成。花 香挥发物主要是植物的次生代谢产物。目前通过固相微萃取技术已经从花香成分中鉴定出 了 2000多种化合物。单祗是植物花香的重要组成成分，参与直接和间接抵御虫害，植物吸 引授粉者，植物与植物间信息交流等行为。此外，单祗通过影响花弁的香味特征间接的影响 花弁的经济价值。
[0003] 很多植物的花通过释放香味来吸引授粉者。尽管很多花香挥发物的结构已经研 究的很清楚，但是很少有人关注运些挥发物在植物体内的合成途径，直到E.Pichersky等 从仙女扇中第第一次克隆得到沉香醇合酶基因，并发现该基因编码的沉香醇合酶能够催化 GPP产生s-linalool。人们开始关注花香挥发物代谢途径及其关键的酶基因，越来越多的 单祗合酶基因被克隆得到。至今，研究者从多种植物中，通过转录组测序，cDNA文库筛选和 常规PCR技术，得到了多种祗締合酶基因。通过底物反应，GC-MS分析，克隆得到的祗締合酶 基因主要控制WGPP和FPP为底物的单祗和倍半祗物质的合成。并且研究主要集中在葡萄、 拟南芥、金鱼草、紫苏、薄荷等双子叶植物中。现在，研究者一般采用化adspace或其它方法 分析植物花香成分，找出其主要成分，通过生物信息学和分子生物学方法克隆相关基因，研 究其成分的变化。Niels等采用化adspace分析雜猴桃的香气，分析得到其主要成分为法尼 締和香叶締-D，克隆得到法呢締合酶基因和大根香叶締-D合酶基因。Danilo采用相同的 研究方法，分析在百合水仙的花香中，香叶締为主要成分，并克隆得到相关的香叶締合酶基 因。而在单子叶植物中研究较少，只有在玉米中报道，Kollner等人于2004年和2008年分 别在玉米的不同品种中克隆得到多种倍半祗締合酶基因，2008年Lin等人也从玉米中得到 了 2种松油醇合酶基因。
[0004] 针对祗締合酶的研究主要集中于双子叶植物和一些经济型作物和模式植物，对于 单子叶植物和观赏花弁植物的研究，可能会对祗类物质的代谢，和花弁的改良提供更多的 信息。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的是提供具有控制合成多种单祗物质的编码香雪兰a-松油醇 合酶基因的cDNA序列和由此推断的氨基酸序列。
[000引本发明首次从红花香雪兰花瓣中克隆得到a-松油醇合酶基因（领77议的新cDNA，并确定了它的核巧酸序列和由此得出氨基酸的序列。另外，领7化基因在大肠杆菌细 胞中成功的表达了所述的印TES蛋白，并且发现表达的重组蛋白在体外酶活实验中可W将 GPP催化生成a-松油醇为主的多种单祗物质。同时研究还发现：在香雪兰开花过程汇中 领775基因表达与a-松油醇的释放具有显著的相关性。
[0007] 本发明的技术方案： 为了从首次从香雪兰中克隆得到巧?r化基因，本发明首先利用山字草沉香醇合酶基因 为探针，对红花香雪兰转录组测序获得的EST数据库进行本地检索，获得一个长度为783bp 的基因片段，然后通过RACEPCR技术，W红花香雪兰花瓣cDNA为模板，克隆得到1917bp的 巧?7化基因的全长cDNA序列。该序列与香雪兰的沉香醇合酶序列（linaloolsynthase由 本实验室教曼博±获得）同源性最高为66%。其次与葡萄中的a-松油醇合酶序列、罗勒 締/月桂締合酶、月桂締合酶蛋白序列W及黄花葛中的沉香醇合酶蛋白序列同源性较高为 52%，开放阅读框架长1788bp，其编码的蛋白序列长595个氨基酸，推测蛋白质的分子量是 68, 710Da，等电点为5. 68。分析结果还显示，本基因具有祗类合酶保守的结构域。
[0008] 在祀T-32 (a+)原核表达载体中插入克隆得到的的巧?r化基因，并且转入到大肠杆 菌化21 〇)E3)细胞中，表达重组TES蛋白。
[0009] 进行香雪兰TES蛋白的体外酶活反应，气谱质谱（GC-MS)检测反应产物，结果显示 反应产物中有多种祗类物质的生成，说明原核表达制备的TES蛋白有催化GPP合成祗类物 质的能力，初步证明我们克隆得到的基因是a-松油醇合酶（a-te巧ineol)基因。
[0010]W红花香雪兰花朵各个时期RNA为模板，设计巧?r化基因特异性PCR引物，进行半 定量RT-PCR实验，确定巧?7E5基因在花朵开发各个时期基因相对表达量。利用SPSS软件 分析巧?7E5基因在花朵开发各个时期基因相对表达量与a-松油醇挥发量的相关性，结果 表明：领7E5基因在花朵开发各个时期基因相对表达量与a-松油醇挥发量具有相关性。
[0011] 香雪兰领粗盛因的cDNA的序列和氨基酸序列信息如下： 其中1 :香雪兰领7K盛因的全长cDNA序列（SEQIDNO. 1)
【附图说明】
[0012] 图1 :印TPS蛋白保守结构域和活性位点分析； 图2 :pET32a-巧?r化质粒酶切和重组蛋白纯化电泳图； 图3 :FhTPS蛋白体外酶活反应体系反应产物测试，A:对照组1(无GPP)B:对照组2(无蛋白乂：实验组。酶活检测结果图表明A和B两个对照组物产物产生，排除了环境干扰和 底物自发产生产物的可能性。而C实验组检测到了多种产物，且有一种产物是主要成分。产 物分别是：1. IR-nPinene 1R-羡締，2. S油inene松祗，3. JiPinene羡締，4. JiMyrcene n月桂締，5. D-Limonene D-巧樣締，6. Eucalyptol按树脑，7. trans-4-thujanol反 式-4-侧柏醇，8.Isote;rpinolene异-异松油締，9. 5-Isop;rop5d-2-methy化icyc lo[3. 1.0化exan-2-ol 5-异丙基-2-甲基二环[3. 1.0]己烧-2-醇，10. .Alpha-Te巧ineol a-松油醇； 图4 :开花过程中巧?r化基因表达与a-松油醇释放模式之间相关性分析。
[0013]
【具体实施方式】 在下面的具体实施例子中进一步说明了本发明，运并不限制本发明的范围。
[0014] 实施例1:领巧'盛因全长的克隆 领7E5基因全长序列的获得：利用山字草沉香醇合酶基因为探针，对红花香雪兰转录 组测序获得的EST数据库进行本地检索，获得一个长度为783bp的基因片段，该片段包 括ATG起始密码子，应该需进行3'RACE-PCR扩增基因3'末端，扩增引物为：上游引物： 5'-CTCGTTGTCGTTAGAGCCATCA-3' 下游引物：5'-GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTT TT-3'，扩增测序得到一个长度为1285bp的cDNA片段。然后将长度为783bp的基因片段和 该长度为1285bp的cDNA片段拼接得到巧?r化基因cDNA全长。随后设计特异的引物，即5' -GGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATT-3' 的上游引物和 5'-GGAGCTCTCCCATATGGTCGACCTG-3' 的 下游引物，得到的PCR产物即为领r化基因全长序列。
[001引实施例2 :领7E5基因在大肠杆菌细胞中的表达 为了表达FhTES蛋白，利用克隆得到的全长领巧盛因作为模板，分别带有Afc口巧口 酶切位点的引物进行领巧'盛因开放阅读框的PCR扩增。上游引物：5'-GTCACCATGGC GTGTCTTCCATTCCA-3' ；下游引物 5' -TATGCGGCCGCTTAGAGGGAAACAGGTTGTATAAGA-3'。
[0016] 分别利用Afco巧日两种限制性内切酶消化上述扩增得到的DNA片段，并将其 克隆进入质粒祀T-32 (a+)，运样构建的重组质粒命名为祀T-32a-巧?巧乂并导入大肠杆菌 BL2UDE3)细胞中。
[0017] 培养所述的转化体表达印TES蛋白，将获得的菌液上清纯化得到重组的印TES蛋 白。
[0018] 实施例3:FhTES蛋白的体外酶活检测
反应条件：30°C，过夜反应，加入己正戊烧终止反应。将反应溶液超声震荡，使溶液充分 混匀，静置分层，用上样针吸取上层的有机相加入GC-MS仪器中，进行检测。
[0019]GC-MS检测结果表明：体外酶活检实验，产物中有祗类物质的生成，说明原核表达 制备的TES蛋白有活性，初步证明我们分离的基