重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法 及其用途。
【背景技术】
[0002] FGF18是FGF家族的一个新成员，是一种可分泌蛋白。1998年，日本科学家 化bayashi首次从老鼠胚胎中分离得到了FGF18。人FGF18基因编码一个207氨基酸组成 的蛋白序列，分子质量约为23kDa。序列分析结果表明，FGF18基因是由207个氨基酸组成 的高度保守的序列，小鼠FGF18与人及大鼠的氨基酸序列具有99. 5%和99%的同源性。在 结构上，FGF18和FGF8、FGF17相似，为同一亚家族成员，具有70%~80%的氨基酸序列同 源性。FGF18在骨骼生长发育过程中扮演着重要的角色，也参与皮质神经元活动，腺垂体的 生存、分化和增殖及调节头发的生长和皮肤修复。体外和体内的多项研究表明，FGF18在形 态发生、血管形成、肿瘤生长和其他细胞发育过程中也发挥着重要的作用。
[0003] 由于FGF18的发现对于骨骼性疾病W及脱发症的治疗有着重要意义，对于FGF18 的研究W及临床应用的前景日益受到人们的关注。因此，FGF18蛋白具有广阔的市场前 景。然而，目前FGF18蛋白表达水平低，同时很难制备具有高活性的蛋白。运些已经构成了 FGF18基础研究和临床应用的瓶颈问题。
【发明内容】
[0004] 本发明在前期研究基础上，构建了W杆状病毒为载体的FGF18昆虫细胞表达 系统，同时计划对于在系统中影响目的蛋白表达量的主要影响因素，如病毒的浓度滴度 (M0I)，收获时间（T0I)W及细胞的状态等相关因素进行优化。 阳0化]因此，本发明的目的之一是提供一种重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产 方法，本发明通过利用昆虫细胞表达系统，对于影响蛋白表达量的主要影响因素，如病毒的 浓度滴度（M0I)，收获时间灯01) W及细胞的状态等相关因素进行优化，解决了FGF18不能 稳定高效表达且不影响其蛋白生物活性的问题，同时通过CM-Se地arose FF阳离子交换和 肝素亲和层析柱的两步法分离纯化技术，解决了FGF18蛋白纯度低的问题。。
[0006] 本发明的还有一个目的是提供重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白用于治疗骨 骼性疾病和脱发症的用途。 阳007]为此，本发明提供的技术方案为：
[0008] 一种重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，包括W下步骤：
[0009] 步骤一、利用昆虫杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中表达成纤维细胞生长因 子-18蛋白，具体包括：
[0010] 1)获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18,其中FGF18基因为成纤维细胞生长因子-18 基因，其碱基序列如SEQIDNO: 1所示，
[0011] 2)用步骤1)得到的M0I为1~32的Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞， 侵染后于溫度25~29°C下培养1化~9化后收获细胞液；W及，
[0012] 步骤二、从步骤一收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白。
[0013] 优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤 2)中，所述Bacmid-FGF18重组杆状病毒的M0I为3. 5。
[0014] 优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤 2)中，用Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞后于溫度27°C下培养9化后收获细胞。
[0015] 优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤 2)中所述重组杆状病毒Bacmid-FGF18为第四代重组杆状病毒。
[0016] 优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤 1)中，获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18的具体方法包括：
[0017] 步骤1.1)W人工合成含有FGF18基因的载体为模板，利用如SEQIDN0:2和SEQ IDN0:3所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDN0:1所示的核巧酸序列的基因片段， 并将其构建到pFas巧ac质粒上W得到pFas巧ac-FGF18重组载体；
[0018] 步骤1. 2)利用步骤1. 1)中得到的pFas巧ac-FGF18重组载体转座含有Bacmid质 粒的E.Coli畑lOBac感受态细胞中，从而使其发生同源重组W得到Bacmid-FGF18重组载 体；
[0019] 步骤1. 3)利用Bacmid-FGF18重组质粒转染昆虫细胞W得到第一代重组杆状病 毒；W及，
[0020] 步骤1. 4)将步骤1. 3)中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞W表达得到第 二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法侵染昆虫细胞直到得到第四代重组杆状病毒。
[0021] 优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤 二中，从步骤一中收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白的具体过程包 括：
[0022] 2. 1)将步骤一中收获的细胞液于14000g离屯、15min，取上清经0. 22ym滤膜过滤 得滤液；
[0023] 2. 2)将步骤2. 1)中得到的滤液使用阳离子交换柱进行层析并收集得到FGF18蛋 白粗样品；W及，
[0024] 2. 3)将步骤2. 2)中得到的FGF18样品再使用肝素亲和层析柱进行层析，并收集得 到FGF18蛋白样品。
[00巧]优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤 2.2) 中，将步骤2.1)中得到的滤液使用阳离子交换柱进行层析的具体过程包括：
[00%] 首先将步骤2. 1)中得到的滤液上样至CM-琼脂糖凝胶FF阳离子交换柱，然后使 用10柱体积的溶液A清洗层析柱，再用20柱体积的溶液A和溶液B的混合溶液于时间 90min内使溶液B的比例从0%升至100%进行梯度清洗，并收集FGF18蛋白粗样品。
[0027] 优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤 2.3) 中将步骤2. 2)中得到的FGF-18样品再使用肝素亲和层析柱进行层析的具体步骤包 括：
[0028] 首先将步骤2. 2)中得到的FGF18蛋白粗样品上样至肝素亲和层析柱，然后使用10 柱体积的溶液A清洗层析柱，再用20柱体积的溶液A和溶液C的混合溶液于时间90min内 使溶液B的比例从0%升至100%进行梯度清洗，并收集FGF18蛋白样品。
[0029] 优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述昆虫 细胞为S巧细胞。
[0030] 重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白用于治疗骨骼性疾病和脱发症的用途。
[0031] 本发明的有益效果为：
[0032] 本发明构建了W杆状病毒为载体的FGF18昆虫细胞表达系统，同时对于在系统 中影响目的蛋白表达量的主要影响因素，如病毒的浓度滴度（M0I)，收获时间（T0I)W 及细胞的状态等相关因素进行了优化，实现了在昆虫细胞中FGF18的表达，同时利用 CM-Se地aroseFF阳离子交换和肝素亲和层析柱分离纯化目的蛋白，经两步法最终获得蛋 白纯度超过95 %的FGF18重组蛋白，不但显著提高FGF18重组蛋白的表达量，而且简化了纯 化工艺，提高了收率，为FGF18蛋白药物提供了一条高效、稳定的生产新途径。为今后开展 产业化生产奠定了基础。
【附图说明】
[0033] 图la为本发明其中一个实施例中Bacmid-FGF18载体的PCR鉴定的部分凝胶电泳 结果图。
[0034] 图化为本发明其中一个实施例中pFas巧ac-FGF18载体的PCR鉴定的部分凝胶电 泳结果图。
[0035] 图2a为本发明其中一个实施例中显微镜下观察到的正常的昆虫细胞的照片。
[0036] 图化为本发明其中一个实施例中显微镜下观察到的病毒侵染的昆虫细胞的照 片。
[0037] 图3为本发明其中一个实施例中FGF18蛋白表达情况的Westernblot鉴定示意 图。
[003引 图4为本发明其中一个实施例中FGF18蛋白分子量的Westernblot鉴定示意图。
[0039] 图5a为本发明其中一个实施例中显微镜下观察到的正常的昆虫细胞的照片。
[0040] 图化为本发明其中一个实施例中显微镜下观察到的病毒侵染的昆虫细胞的照 片。
[0041] 图6为本发明其中一个实施例中不同病毒转染时间对FGF18蛋白表达影响的曲线 不意图。
[0042] 图7为本发明其中一个实施例中经两步法纯化后的FGF18蛋白的Western blot 鉴定不意图。
【具体实施方式】
[0043] 根据本发明，可采用本领域技能中的常规分子生物学、微生物学、细胞学和DNA重 组技术。如果出现于本文下来术语的定义如下。
[0044] "DNA分子"指脱氧核糖核巧酸（胸腺喀晚、胞喀晚、腺嚷岭或鸟嚷岭）的聚合形式， 是染色体主要组成成分，同时也是组成基因的材料。运一术语只指分子的一级和二级结构， 不限制其任何具体的S级形式。本术语包括特别是在线性DNA分子、病毒、染色体、质粒中 国发现的双链DNA。运里讨论的结构，按照习惯上给出的只是DNA正义链的5'到3'方向的 序列。
[0045]"载体"是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是"质 粒"，质粒是其他的