一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种血管紧张素转化酶抑制肤的制备方法，尤其是设及一种海马血管 紧张素转化酶抑制肤的制备方法。
【背景技术】
[0002] 海马又叫水马、海狗子、马头鱼、龙落子等，为介类硬骨鱼，在分类上属于鱼纲、海 龙目、海龙科、海马属的海产鱼类。海马种类较多，分布较广，目前已知的有35种。一般多 分布于热带、亚热带的近陆浅海海藻、海草生长丰富的海域中。分布于我国沿海附近的常见 海马有：S斑海马（化切fri曲aci/ia加SLeach)、大海马（度左化/a Bleeker)、日本 海马（度知公〇打ic化？Kaup)、刺海马（度Ai別rix Kaup)和线纹海马（度知心邸知化rdan et Snyder)。在中国，海马是一种名贵的中药材，有很多功效，被人们称为"南方人参"。据 《本草纲目》记录，海马具"主难产及血气痛，暖水脏，壮阳道，消瘤块，治疗疮肿痛"等功效。 在我国海马的药用价值历史悠久，梁代陶弘景在《本草经集注》中已有海马药用的记载，而 欧洲18世纪开始也将海马入药。目前海马在医药上的主要功能有：用于阳瘦、不育、哮喘、 虚烦不眠、腰腿痛、铁打损伤、外伤出血、腹痛、难产、乳腺癌、瘤块等。
[0003] 据测定，海马中蛋白质含量占海马干重的67. 9-73. 56%，各类氨基酸含量比较均 衡，对海马蛋白进行酶解制备生物活性肤具有重要的意义。生物活性肤是蛋白质中20个 天然氨基酸W不同组成和排列方式构成的从二肤到复杂的线性、环形结构的不同肤类的总 称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肤在自然界中是广泛存在的，没有肤，就没有活性， 就没有生命。现代营养学研究发现：人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是W低肤形 式消化吸收的，W游离氨基酸形式吸收的比例很小；进一步试验掲示肤比游离氨基酸消化 更快、吸收更多，表明肤的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。活性肤具有多种人体代 谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作 用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热口的研究课题和极具发展前景的功能因子。由 于生物活性肤具有运些特殊的功能，使得人们对活性肤的需求量急剧增加，目前，已有许多 活性肤应用在保健和医疗上。
[0004] 血管紧张素转化酶抑制肤是一类具有抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的多肤物 质。运类多肤由于其有降血压的功能，所W又称为降血压肤。血管紧张素转化酶抑制剂（ACE I)根据来源可分为天然和人工合成两大类，目前临床上使用的ACEI都是人工合成的。运 类药物的作用机理是作为竞争性抑制剂与ACE结合，从而扰乱血管紧张素II的生成。人工 合成类高血压药物对人体会产生一定的负作用，如咳嗽、皮肤痊痒、味觉素乱及血压过度降 低等。因此，天然血管紧张素转化酶抑制肤是今后研究与发展趋势之一。海洋拥有特殊的 生态环境，赋予了海洋生物异于陆生生物所特有的化学成分和结构，具有特异的高活性、高 药效。近年来对海洋药物的研究越发深入，越来越多的研究发现生物活性肤具有很好的医 疗保健功效，具有抗肿瘤、抗氧化、降血压、抗疲劳、增强免疫力等活性。而海马是重要的中 药材，因此利用海马蛋白来开发ACE抑制肤具有重要的药用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、操作方便且本法制备多肤水解 度高，多肤片段分子量较小、活性高的海马血管紧张素转化酶抑制肤的制备方法。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海马血管紧张素转化酶抑制 肤的制备方法，包括W下步骤： (1) 海马前处理：将海马洗净冻好后，于-80 °C下冷冻干燥48h，再用粉碎机粉碎，然 后采用C〇2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉； (2) 海马蛋白液制备：将步骤（1)得到的脱脂海马粉与水按40-60g/L的比例混合后，依 次用膜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，用滤纸过滤取上清液，即为海马蛋白酶解液；将海马蛋 白酶解液用截留分子量为20KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量大于20KDa的滤液，并进行 浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉； (3)ACE抑制肤制备：将步骤（2)中得到的海马蛋白粉与水按400-600g/L的比例混合 后，加入海马蛋白粉质量5%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解溫度为59 °C，时间为7.5h，pH 为7. 7,将酶解液沸水灭活10分钟后，于4000巧m离屯、10min,取沉淀冷冻干燥即得到海 马ACE抑制肤粉末； (4)ACE抑制肤纯化：采用Se地adexG-15凝胶过滤对步骤（3)制备得到的ACE抑制肤 粉末进行分离纯化，上样量2mL，ACE抑制肤粉末浓度为0. 05g/mU洗脱速度1. 0mL/min， 3血/管，收集PH-I3、PH-I4和PH-I5S个组分；采用反相高效液相色谱法分别对PH-I3、 PH-I4和PH-I5S个组分进行分离纯化，设置A相为含有体积百分数0. 1%S氣乙酸的水 溶液，B相为含有体积百分数0. 1% =氣乙酸的乙腊溶液进行梯度洗脱，检测波长为220nm， 其中PH-I3的洗脱条件为0-35min，0-32%B相，流速为1血/min,收集组分PH-I3-5 ;PH-I4 的洗脱条件为〇-l〇min，100%A相；10-40min，0-24%B相，流速为1血/min,收集组分 PH-I4-3 ;PH-I5的洗脱条件为0-40min，0-35%B相，流速为0. 8血/min,收集组分PH-I5-3， 合并PH-I3-5、PH-I4-3和PH-I5-3S个组分，冷冻干燥，即得到高活性的ACE抑制肤粉末。
[0007] 步骤（1)中所述的C〇2超临界萃取技术进行脱脂的条件为：萃取溫度为58°C、萃取 压强为35MPa、静态萃取lOmin后调节C02流量为15LA、动态萃取时间为125min的萃取条 件下对海马骨粉进行脱脂。
[0008] 步骤（2)中所述的膜蛋白酶的酶解条件为溫度45 °C、时间4h、pH8. 8、添加质量 为脱脂海马粉的4%;碱性蛋白酶酶解溫度54. 70°C、时间6h、pH9.0、添加质量为脱脂海马 粉的为4〇/〇。
[0009] 所述的海马包括大海马、=斑海马、线纹海马、日本海马、刺海马。
[0010] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种海马血管紧张素转 化酶抑制肤的制备方法，其利用木瓜蛋白酶酶解海马蛋白制备ACE抑制肤省时、高效，且工 艺简单、操作方便、仪器设备要求低，能耗小，避免化学方法制备多肤过程中的残留和污染， 且本法制备多肤水解度高，多肤片段分子量较小，更有利人体小肠的吸收。酶解后ACE抑制 肤的ICso为2. 028 + 0.llOmg/mL，木瓜蛋白酶的ACE的半抑制浓度明显小于其它的蛋白酶， 说明木瓜蛋白酶的酶解产物具有较好的降血压功能。通过响应面法对木瓜蛋白酶进行水解 条件的优化，W达到海马蛋白最优的水解条件，在最优的酶解条件下，得到多肤ACE的半抑 制浓度ICs。为1. 997±0. 094mg/血。经进一步分离纯化后活性大幅提高，最强活性C5。值为 75. 93 + 3. 59jig/mL。
【附图说明】
[0011] 图1为添加量对木瓜蛋白酶酶解效果的影响； 图2为酶解时间对木瓜蛋白酶酶解效果的影响； 图3为酶解PH对木瓜蛋白酶酶解效果的影响； 图4为酶解溫度对木瓜蛋白酶酶解效果的影响； 图5为PH-IS巧hadexG-15蒸馈水洗脱曲线； 图6为PH-I1、PH-I2、PH-I3、PH-I4和PH-I5各组分的ACE抑制活性分析图； 图7为反相高效液相色谱法分离纯化组分PH-I3的色谱图； 图8反相高效液相色谱法分离纯化组分PH-I4的色谱图； 图9反相高效液相色谱法分离纯化组分PH-I5的色谱图。
【具体实施方式】
[0012] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[001引一、实验测定方法 1、氨基酸组成成分分析 1.1多肤蛋白样品的酸水解 多肤蛋白样品酸水解：取一定量的多肤蛋白样品，转移至水解管中，加入ImL6N的盐 酸，充入N2约lOmin，之后密封后放置于Block化ater干式加热器模块中，110°C水解反应 2地。反应完毕后，将游离氨基酸溶液转移至1.5mLEP管中，抽真空浓缩至干。
[0014] 1. 2异硫氯酸苯醋（P口C)衍生方法： 混合氨基酸标准品衍生化处理：取25yL混合氨基酸标准品溶液，加入12. 5yLImoL/LS乙胺满旋混合震荡，之后加入12. 5iiL0.Imol/LPITC满旋混合震荡室溫静置比，加 入100jiL正己烧剧烈混合震荡后静置lOmin，取下层溶液20jiL加入180jiL流动相A溶 液，混合后0. 22ym过滤处理待测试。
[0015] 样品溶液衍生化处理：取适量流动相A液复溶已冻干样品游离氨基酸，取25iiL样 品氨基酸溶液，加入12. 5yLImoL/LS乙胺满旋混合震荡，之后加入12. 5yL0.Imol/L PITC满旋混合震荡室溫静置比，加入100yL正己烧剧烈混合震荡后静置lOmin，取下层溶 液20y以加入180yL流动相A溶液，混合后0. 22ym过滤处理待测试。
[0016] 1.3高效液相色谱测试 衍生化好的氨基酸衍生物通过岛津高效液相色谱仪LC-20A分离检测，相关参数如 下：A液为0.05mol/L乙酸钢水溶液，B液为甲醇乙腊水溶液（甲醇：乙腊：水=20:60:20 (V:V:V))。流速为：1. 0血/min;柱溫：35°C;色谱柱W95%的A液平衡后，样品由自动进样器 上样到氨基酸分析柱。分离梯度为：0分钟-39分钟，B液线性梯度从5%到