生物除磷功能菌的筛菌用培养基及强化除磷的筛菌方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体设及生物除憐功能菌的筛菌用培养基及强化除憐的筛菌方法。
【背景技术】
[0002] 生物除憐系统中的功能菌在厌氧一好氧交替的环境中生存。厌氧阶段，聚憐菌 分解体内的聚憐颗粒释放能量和憐酸盐，用来吸收底物形成聚-beta-径基-链烧酸醋 (PHAs)，而聚糖菌则分解体内的糖原释放能量来吸收底物形成PHAs;好氧阶段，聚憐菌消 耗体内的PHAs作为能量来源生长和吸收憐酸盐，而聚糖菌则消耗体内PHAs来生长和合成 糖原。在W上过程中，厌氧阶段的底物充足与否直接影响到聚憐菌和聚糖菌的体内PHAs储 备是否充分；好氧阶段的底物如果过多，聚憐菌和聚糖菌不消耗体内PHAs,从而导致除憐 率降低和糖原合成不足。运用传统筛菌方法筛选生物除憐功能菌时，忽视了W上运行环境 对菌体生长和功能的影响。
[0003]目前筛选生物除憐微生物的方法都是将从反应器中取出的污泥置于传统培养基 巧曰牛肉膏蛋白腺培养基）中于室溫摇瓶培养增殖，将增殖后的菌液稀释后，涂布于固体传 统培养基进行筛选，W上方法存在W下问题： 1.针对性不强。传统筛菌方法是一种"广撒网式"的筛菌方法，没有考虑到功能菌是在 厌氧一好氧交替变化的生存环境下出现生理功能的，也就是说没有针对功能菌厌氧好氧交 替变化下的生理特性进行筛选。
[0004] 2.杂菌滋生。由于传统的细菌培养基适和所有细菌生存，且其中成分与生物除憐 系统的功能菌出现生理功能巧日聚憐菌出现除憐效果）的生长环境不同，势必导致一些非聚 憐菌大量繁殖，使得培养液中的聚憐菌比例下降。
[0005] 3.培养基不合适。生物除憐微生物是在厌氧一好氧交替变化的生存环境下出现生 理功能，即聚憐菌厌氧释憐好氧吸憐，聚糖菌厌氧分解糖原好氧合成糖原。在运两个不同的 时期，功能菌所需的底物和憐元素含量是不同的，而传统培养基没有考虑到运一点。
[0006] 4.工作量大。经过了富集培养之后需要将菌液稀释后涂布平板，挑取单菌落进行 更进一步的分离纯化。由于W上=条，经过传统培养基筛选出来的菌液中杂菌比例增大，因 此需要挑取更多的菌落确保可W分离到功能菌株，运就增加了分菌的工作量，W后进一步 验证运些菌是否为生物除憐功能菌时的工作量会更大。因此需要更合适的培养基和筛选方 法来分离培养W及加强生物除憐功能菌株。
【发明内容】
[0007]针对现有技术存在的问题，本发明提供一种生物除憐功能菌的筛菌用培养基及强 化除憐的筛菌方法，所述筛选用培养基按照筛菌的顺序分为厌氧相筛选用培养基，好氧相 筛选用培养基，固态分菌用培养基和液态分菌用培养基，其中厌氧相筛选用培养基和好氧 相筛选用培养基分别模拟厌氧阶段和好氧阶段的生长环境，更适于功能菌的生长，从而进 一步将杂菌淘汰掉，固态分菌用培养基和液态分菌用培养基可强化功能菌的生长；所述筛 菌方法充分考虑了运行环境和底物环境对功能菌的影响，在厌氧-好氧富集过程模拟反应 器运行厌氧-好氧环境交替，使杂菌逐渐被淘汰，而使功能菌继续生存。本发明的技术方案 为： 生物除憐功能菌的筛菌用培养基按照筛菌过程的使用顺序依次为厌氧相筛选用 培养基、好氧相筛选用培养基，固态分菌用培养基和液态分菌用培养基，其中每升厌 氧相筛选用培养基是由0. 6~0. SgC&COOKiO. 2~0. 4邑邸3邸2〇)0胞，330~350mgNH4Cl， 490~510mgNa2S〇4,41~43mgCaCl2 ? 2H2〇,390~410mgMgCl2 ? 6H2〇，；34~36mg化2EDTA ? 6电0， 0.5~1.5mL微量元素液，2~4mL维生素液和余量的蒸馈水组成；每升好氧相筛选用培 养基是由90~llOmgN址2P04，158~160mg化2册〇4,490~510mg化2S04,390~"OmgN&Cl， 48~SOmgCaClz .2&0,440~460mgMgCl2.6&0,：34~36mgNa2邸TA .6&0,1. 2~1. 4血微量元素液， 3. 4~3. 6血维生素液和余量的蒸馈水组成；每升固态分菌用培养基是由0. 6~0. SgC&COOK， 0. 2~0. AgCHsCHzCOONa，158~160mgNa2HP〇4,90~llOrngNaHsPO*，330~350mgNH4Cl， 41~43mgCaCl2 ? 2电0,390~"OmgMgClz ?細2〇,490~510mgNa2S〇4,34~36mg化2抓TA ? 6电0， 0. 9~1. 1血微量元素液，2. 9~3. 1血维生素液，14~16g琼脂和余量的蒸馈水组成；每升 液态分菌用培养基是由 0.6~0.SgC&COOKiO.2~0.AgC&C&COONa，158~leOmgNazHPO" 90~1lOmg化H2PO4,330~350mgNH4Cl，41~43mgCaCl2?2也0,390~"OmgMgClz? 6H2O， 490~510mgNa2S〇4,：34~36mgNa2邸TA ? 6&0,0. 9~1.ImL微量元素液，2. 9~3. ImL维生素液和余 量的蒸馈水组成。
[000引所述微量元素液的成分和浓度为：化I0. 5g/l，Fe2(S04)3 6. 5g/l，化化? 2&0 0. 07g/l，aiClz0. 17g/l，MnS04 ? &0 0. 3g/l，NazMcA? 2&0 0. 18g/l，CoS04 ? 7&0 0. 53 邑/1，&8030. 45g/L。
[0009] 所述维生素液的成分和浓度为：维生素B1 150mg/l，维生素B2 150mg/l，维生素 B6 300mg/U维生素B12 3g/l，泛酸巧150mg/l，烟酸150mg/L叶酸60mg/U对氨基苯 甲酸 150mg/L。
[0010] 采用上述厌氧相筛选用培养基、好氧相筛选用培养基，固态分菌用培养基和液态 分菌用培养基，强化除憐的筛菌方法，按照W下工艺步骤进行： (1) 按照所述厌氧相筛选用培养基、好氧相筛选用培养基、固态分菌用培养基和液态分 菌用培养基的成分及浓度配置四种培养基，备用； (2) 取生物除憐反应器中好氧结束的污泥离屯、聚集，弃去上清液后将聚集物用无菌水 冲洗3~4次； (3) 将厌氧相筛选用培养基置于血清瓶中，吹入氮气至氧气排尽，加入步骤（2)的污泥 聚集物，室溫下静置12~1化； (4) 将步骤（3)的厌氧血清瓶中的上清液倒出，残留物揽拌混匀后离屯、聚集； (5) 将好氧相筛选用培养基置于=角瓶中，加入步骤（4)的聚集物，采用透气滤膜封口， 室溫下摇床摇12~1化，得到菌悬液； (6) 将步骤（5)的菌悬液重复实施步骤（2)~ (5)7~8次，最终得到的菌悬液于 4000~420化/min离屯、聚集，弃去上清液； (7) 将步骤（6)的聚集物与无菌水混匀得到菌悬液，将菌悬液浓度稀释10 6~10 8倍，涂 布于固态分菌用培养基平板，室溫下培养24~4化； (8) 挑取步骤（7)的单菌落接种到液态分菌用培养基中室溫下摇床培养20~28h; (9) 将步骤（8)中得到的菌悬液进行镜检，观察菌株形态：菌株形态不一致时将菌悬液 离屯、聚集后重复实施步骤（7) ~ (9) 4~6次获得除憐功能菌的纯菌株；菌株形态一致时，直 接进行下一步； (10) 将步骤（9)中获得的除憐功能菌的纯菌株菌悬液倒入10ml离屯、管中离屯、得到聚 集的菌体； (11) 对步骤（10)的除憐功能菌的纯菌株进行除憐能力的检测，确定筛选的纯菌株除憐 功能加强。
[0011] 将步骤（2)的污泥聚集物在厌氧血清瓶中放置12~1化，可W将一些专性好氧菌筛 掉，确保留在污泥中的都是与生物除憐有关的功能菌；将步骤（4)的污泥聚集物置于好氧 S角瓶中摇12~1化，由于所用培养基无底物，所W-些没有在厌氧阶段聚集PHA的好氧菌 就不会生长，能够吸收憐的还是一些功能菌，而厌氧和好氧都持续12hW上，运种极限状态 也是为了达到彻底筛除杂菌的目的。
[0012] 检测筛选的纯菌株除憐能力的方法为：①按照所述厌氧相筛选用培养基、好氧相 筛选用培养基、固态分菌用培养基和液态分菌用培养基的成分及浓度配置=种培养基，备 用；②取1ml纯菌液置于装有60ml液态分菌用培养基的S角瓶中，置于18~20°C摇床 中培养24~4化；③将S角瓶中的菌液分批倒入灭过菌的15ml离屯、管中，于4000~420化/ min离屯、10~15min，弃去上清液，收集菌体；④向15ml离屯、管中注入10ml厌氧筛选用 培养基混匀，吹入纯氮气2~3min，梓紧瓶盖，置于18~20 °C摇床中培养2~化；⑥将离 屯、管于4000~420化/min离屯、10~15min，弃去上清液，收集菌体；⑧向离屯、管中注入好氧 筛选用培养基10ml，曝气2~3小时；⑦重复实施步骤③~⑧6~8次进行菌株的驯化；⑨ 将驯化的菌液于4000~42(K)r/min离屯、10~15min，收集菌体，弃去上清液；⑨离屯、管中 注入10ml厌氧筛选用培养基混匀，吹入纯氮气2~3min，梓紧瓶盖，置于18~20 °C摇床 中培养2~化；⑩将离屯、管离屯、，使菌体沉淀，测量上清液中的憐含量，之后弃去上清液； 皎向离屯、管中注入检测用培养基6ml混匀，曝气2小时，分别在20分钟、40分钟、60分钟、 90分钟、120分钟取样0. 6ml，置于1. 5ml离屯、管中，于4000~4200r/min离屯、5~8min，弃去 沉淀，检测不同时间点的上清液中的憐浓度；?菌浊测定：将步骤(Q)中取样之后的剩余菌 液3ml离屯、，弃去上清液，加入蒸馈水稀释到30ml，测菌浊（0D600值)。
[0013] 所述步骤>强的检测用培养基的成分及浓度为：NaH2P〇438mg/l，胞2册〇469 mg/l，Na2S〇4500mg/l，NH4CI4OOmg/l，CaClz? 2&0 49mg/l，MgClz. 6&0 450mg/l， 胞2邸TA?6H2O35mg/L微量元素液11111/1，维生素液3ml/L。
[0014] 0D600值是使用分光光度计在波长600时测得的数据，该数据是菌浊的表征数值， 进行处理之后可换算成菌悬液中的菌体浓度。
[0015] 步骤⑨上清液中的憐含量和步骤II不同时间段的液体憐浓度，使用钢酸锭分光