密执安棒形杆菌不同亚种的条形码鉴定方法及其专用引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其设及一种鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的条形码 方法及其专用引物。
【背景技术】
[0002] 棒形杆菌属（Clavibacter，原为Corynebacterium)细菌，1954 年，Davis 将含有2, 4二氨基下酸的一些菌归类并设立了棒形杆菌属新种一密执安棒形杆菌 种（Clavibactermichiganensis)。根据寄主植物的不同一般将密执安棒形杆菌 (Clavibactermichiganensis)分为五个亚种：诡橘亚种（Clavibactermichiganensis subsp.insidiosus，首猜细菌性萎黨病菌）、密执安亚种（Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis,番茄溃瘍病菌）、内布拉斯加亚种（Clavibactermichiganensis subsp.nebraskensis，玉米内州萎黨病菌）、环腐病亚种（Clavibactermichiganensis subsp.s巧edoni州s,马铃馨环腐病菌）、棋盘状亚种（Clavibactermichiganensissubsp. tessellarius，小麦细菌性花叶病菌）。上述病菌均能通过种子或种苗进行远距离传播，并 能造成严重危害，前四个亚种被列为中华人民共和国进境植物检疫性有害生物。
[0003] 口岸检疫是防控有害生物传入传出的有效途径，准确的检测鉴定是口岸检疫的重 要措施，因此加强对该属病原细菌的检测鉴定技术研究具有重要意义。国内外研究人员采 用了多种方法如直接观测法、生物学测定法、血清学检测和分子生物学检测法等对该属细 菌的检测鉴定做了大量的研究。随着育种的国际化和植物种质资源引进交流大幅度增加， 口岸检疫对该属检疫性细菌的检测鉴定方法也提出了更高的要求。棒形杆菌属下的四个检 疫性植物病原细菌，目前常用的分子检测方法主要有PCR凝胶电泳、实时巧光PCR、LAMP等 方法，运类方法适合于目标细菌的特异性检测，但对于未知病原菌的鉴定不适合。
[0004] DNA条形码技术是近年来出现的一种新的物种鉴定技术，由加拿大Guel地大学的 分类学家Paul化bed在2003年首次提出，其在物种标准化鉴定方面的优势已备受关注。 线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(C0I)基因作为动物的DNA条形码已广泛应用于物种鉴定 中；在植物上已选定叶绿体rbcl和matK基因作为基本的DNA条形码；真菌学家正对真菌类 群进行不同基因片段的筛选与评价，W口S作为真菌的首选DNA条形码。条形码技术是分类 学中辅助物种鉴定的新技术，它代表了生物分类学研究的一个新方向，而且随着测序技术 的发展和普及，DNA条形码技术为出入境境检验检疫提供了一种简单而有效而且容易标准 化的方法。在细菌方面，虽然很早就利用16SrDNA序列进行分类与鉴定，但由于16SrDNA 序列的保守性强，区分能力有限，对于种及种下阶元的鉴定很难。植物病原细菌在分类上与 经典的细菌分类还不尽相同，自然感染寄主的差异是病原细菌鉴定的一个重要指标，但在 现实检测中依靠寄主差异进行检测鉴定具有很大难度，目前很多分类学家和检测技术人员 正研究寻找适合细菌种及种下阶元快速鉴定的通用DNA条形码基因。
【发明内容】
阳〇化]本发明的一个目的是提供鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的条形码引物。
[0006] 本发明提供鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的条形码引物，为对片段A进行扩增和 /或测序使用的引物，所述片段A为W密执安棒形杆菌不同亚种的基因组DNA为模板，用序 列1所示的引物和序列2所示的引物进行扩增得到的片段。
[0007] 上述条形码引物中，其由引物cmhspF和引物cmhspR组成；所述引物cmhspF的核 巧酸序列为序列表中序列1，所述引物cmhspR的核巧酸序列为序列表中序列2。
[0008] 本发明的另一个目的是提供鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的PCR试剂。
[0009] 本发明提供的PCR试剂，由上述的条形码引物、PCR扩增缓冲液和水组成，所述条 形码引物中的引物cmhspF和引物cmhspR在所述PCR试剂中的终浓度均为0. 5jiM。
[0010] 本发明的第3个目的是提供鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的PCR试剂盒。
[0011] 本发明提供的试剂盒，包括上述的条形码引物或上述的PCR试剂。
[0012] 上述引物组或PCR试剂或PCR试剂盒中，所述密执安棒形杆菌不同亚种为首猜细 菌性萎黨病菌、马铃馨环腐病菌、玉米内州萎黨病菌、马铃馨环腐病菌及小麦细菌性花叶病 困。
[0013] 上述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在鉴定或区分密执安棒形杆菌不同亚种中 的应用也是本发明保护的范围。
[0014] 上述的引物组或PCR试剂或PCR试剂盒在制备鉴定或区分密执安棒形杆菌不同亚 种产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0015] 本发明第4个目的是提供鉴定或辅助鉴定不同待测密执安棒形杆菌是否为同一 亚种的方法。
[0016] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0017] 1)分别提取不同待测密执安棒形杆菌的基因组DNA，利用上述的引物组进行PCR 扩增，得到不同待测密执安棒形杆菌的PCR扩增产物；
[001引。将所述不同待测密执安棒形杆菌的PCR扩增产物测序，得到不同待测密执安棒 形杆菌的PCR扩增产物序列；
[0019] 3)将不同待测密执安棒形杆菌的PCR扩增产物序列进行聚类分析，聚为一簇的待 测密执安棒形杆菌为一类亚种。
[0020] 上述方法中，所述PCR扩增的退火溫度为55°C。
[0021] 本发明第5个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测密执安棒形杆菌的亚种类型的方 法。
[0022] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0023] 1)分别提取待测密执安棒形杆菌的基因组DNA，利用上述的引物组进行PCR扩增， 得到待测密执安棒形杆菌的PCR扩增产物；
[0024] 2)将所述待测密执安棒形杆菌的PCR扩增产物测序，得到待测密执安棒形杆菌的 PCR扩增产物序列；
[0025] 3)将待测密执安棒形杆菌的PCR扩增产物序列与Genbank数据库密执安棒形杆菌 不同亚种代表种的核巧酸序列进行聚类分析，所述待测密执安棒形杆菌的PCR扩增产物序 列与Genbank数据库密执安棒形杆菌某个亚种的核巧酸序列聚为一簇，则该待测密执安棒 形杆菌为该种亚种。
[0026] 所述方法中，所述Genbank数据库密执安棒形杆菌不同亚种代表种的核巧酸序列 为序列表中序列23-序列29 ;所述PCR扩增的退火溫度为55°C。
[0027] 在上述应用或方法中，所述密执安棒形杆菌不同亚种为首猜细菌性萎黨病菌、马 铃馨环腐病菌、玉米内州萎黨病菌、马铃馨环腐病菌及小麦细菌性花叶病菌。 阳02引本发明的实验证明，使用本发明所提供的引物组cmhspF和引物cmhspR，在验证中 100%扩增到密执安棒形杆菌各亚种，测序成功率为100%，能够有效对该种内不同亚种进 行鉴定，可在进境植物及其产品检疫中应用，防止病原细菌的传入传出，也可在国内的植 保植检站、科研院所、农业生产企业及农户中推广应用。
【附图说明】
[0029] 图1为密执安棒形杆菌不同亚种条形码序列构建的系统进化树。
【具体实施方式】
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1、用于密执安棒形杆菌不同亚种的条形码引物的合成
[0033]WGenbank中密执安棒形杆菌5个亚种序列作为的对象，分析其序列保守区域，根 据条形码引物设计的条件即扩增片段长度、扩增片段种内的保守性和种间的变异性设计并 人工合成引物组cmhspF和cmhspR，用于鉴定密执安棒形杆菌不同亚种，条形码引物扩增产 物长度约为6(K)bp。
[0034] cmhspF的核巧酸序列为序列表中的序列1，cmhspR的核巧酸序列表中的序列2。
[0035] 实施例2、条形码引物鉴定密执安棒形杆菌不同亚种
[0036] 为了验证实施例1制备的用于鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的条形码引物的通 用性，本实施例选择首猜细菌性萎黨病菌、马铃馨环腐病菌、玉米内州萎黨病菌、马铃馨环 腐病菌及小麦细菌性花叶病菌进行评价。
[0037]首猜细菌性萎黨病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. insidiosus)，编号为 NCPPB1634 CMI，LMG7323 CMI，LMG7295 CMI，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
[0038]番茄溃瘍病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. michiganensis)编号为 NCPPB2979 CMM，NCPPB382 CMM，LMG3681 CMM，LMG5604 CMM,公众可从中国检验检疫科学研 究院获得。
[0039]玉米内州萎黨病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. nebraskensis)编号为 ATCC27822 CMN, LMG3700 CMN, NCPPB2581 CMN, LMG5627 CMN, ATCC27794 CMN, ATCC27795 CMN，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
[0040]马铃馨环腐病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. sepedonicus)编号为 LMG5922 CMS，LMG6382 CMS，LMG5861 CMS,公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
[0041]小麦细菌性花叶病菌（Clavibacter michiganensis. subsp. tessellarius)编号NCPPB3664 CMT，ATCC33566 CMT，NCPPB3665 CMT，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。 [0042]菜豆细菌性萎黨病菌（Qi;rtobacte;rium flac州mfaciens pv. Flac州mfaciens)， 编号ATCC51876 CUR,公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
[0043] 1、PCR扩增
[0044] 按照细菌基因组DM提取试剂盒（天根生物技术有限公司，货号：DP302-02)步骤 分别提取各种首猜细菌性萎黨病菌、各种番茄溃瘍病菌、各种玉米内州萎黨病菌、各种马铃 馨环腐病菌、各种小麦细菌性花叶病菌和菜豆细菌性萎黨病菌的基因组DNA，测定浓度后， W各菌基因组DNA为模板，分别使用实施例1的cmhspF和cmhspR引物，根据PCRmaster mi