微流体多孔型细胞培养测试装置的制造方法
【技术领域】
[0001 ] 本公开内容大体上涉及微流体多孔型细胞培养测试装置。
【背景技术】
[0002]通常，通过下述步骤观察细胞对药物的响应:将细胞放入多孔板、注入液体形式的药物并使用光学测定系统监视细胞的时间依赖性变化以获得统计结果。Kirby-Bauer (KB)测试是已知的固体介质中的抗生素易感性测试方法，其中细菌散布在琼脂培养基上，在其上放置吸附有抗生素的纸，并观察细菌生长。在液体培养基中微稀释测试的情况下，已经开发了许多自动化系统，例如VITEK2、Microscan和Phoenix，以用于抗生素易感性测试。此类系统可通过下述过程用于抗生素易感性测试:将抗生素放在微米尺寸的孔中，向孔中与液体培养基一起注射细菌，通过浊度统计学上监视并确定细菌生长。
[0003]当使用常规系统测试细胞对不同药物的响应时，将细胞放入液体或固体培养基中，将药物与液体培养基混合，或者将吸附有药物的纸盘放置在固体培养基上以使细胞对药物响应，通过浊度(吸光度)测定而确定细胞生长对药物的响应。但是，此类方式依赖于统计学有效数据的采集而不是依赖于单个细胞的变化，需要长时间温育(通常16?24小时)，因为需要使至少预定数量的细胞(通常约1，000, 000个细胞/ml)生长以获得统计学结果。在该情况下，不可能监视存在的单个细胞针对药物的变化以及实时监视运动的单个细胞。此外，需要大量时间和劳动来测试大量的药物，因为各个药物是分别注射的。用于在固体培养基中抗生素易感性测试的KB测试基本上要求大量的琼脂培养基板来测试数十种抗生素的易感性，这是因可以放置在固体培养基上的药物的数量受限导致的。VITEK是一种开发用于最小化测试时间的自动化系统，也要求约12小时的相对长时间，因为细菌浊度要增加至预定水平。此外，由于用于常规测试方法的环境不同于体内环境，测试结果和体内出现的现象之间可能存在很多实质性差异(Gregory G.Anderson等，(2003), “Intracellular Bacterial B1fiIm-Like Pods in Urinary TractInfect1ns”, Science 301，105 ;Gallo 等，(2011)，“Demonstrat1n of Bacillus cereusin Orthopaedic-1mplant-Related Infect1n with Use of a Mult1-Primer PolymeraseChain React1n-Mass Spectrometric Assay.，，，J Bone Joint Surg Am, 93)。
[0004]因此，需要开发一种用于抗生素易感性测试的相对于常规技术精确且快速的技术。
【发明内容】
[0005]本发明的一个方面提供一种微流体多孔型细胞培养测试装置，其具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构，每个微流体孔单元包含第一流体穿过其进入的入口、适于在其中收容第二流体的收容室、第一流体流动经过其中的微流体通道和适于促进第一流体的进入的空气出口，其中所述微流体通道与所述入口和所述空气出口连通从而使所述第一流体能流入并填充所述微流体通道，其中所述收容室设计为孔的形式以便保持进入的第二流体，并且在其中所述收容室的下方侧面部与所述微流体通道的侧面部连通之处形成毛细管阀，从而使所述第一流体和所述第二流体彼此相遇而形成界面。
[0006]根据一个实施方式，所述微流体孔单元的尺寸与市售多孔板的各个孔的尺寸一致。
[0007]根据一个实施方式，各个孔布置成1X1、1X2、1X4、2X4、4X6、12X8、24X16或48X32的矩阵。
[0008]根据一个实施方式，所述微流体通道布置成围绕所述收容室以使所述微流体孔单元具有四边形结构。
[0009]根据一个实施方式，所述毛细管阀具有预定厚度和宽度以防止所述第一流体进入所述收容室。
[0010]本发明的另一方面提供一种使用微流体多孔型细胞培养测试装置的细胞分析方法，所述微流体多孔型细胞培养测试装置具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构。每个微流体孔单元包含让含胶凝剂液体介质和生物试剂的混合溶液穿过其进入的入口、适于在其中收容生理活性物质的收容室、与所述入口连通并且所述液体介质流动经过其中的微流体通道以及所述微流体通道的下方侧面部通过其与所述收容室的侧面部连通的毛细管阀。所述细胞分析方法包括下述步骤:(a)向所述入口引入所述含胶凝剂液体介质和所述生物试剂的混合溶液，以在微流体通道中填充所述混合溶液，并使所述混合溶液胶凝而形成固体薄膜；(b)将所述生理活性物质供应至所述收容室中，并使所述生理活性物质通过所述毛细管阀扩散至所述固体薄膜中；和(C)在单个细胞基础上，观察在所述混合溶液和所述生理活性物质彼此相遇的界面处发生的生物试剂的变化。
[0011]根据一个实施方式，步骤(a)可以包括:(a_l)将含有所述生物试剂的溶液引入所述入口以填充所述微流体通道的一部分，和(a-2)进一步将所述含胶凝剂液体介质引入所述入口以使所述液体介质形成层流并且填充所述微流体通道，从而在所述微流体通道的上壁表面和下壁表面上形成所述生物试剂的单层。
[0012]根据一个实施方式，所述细胞分析方法还包括步骤(d):在单个细胞基础上观察所述生物试剂对所述生理活性物质的响应，以确定所述生理活性物质的最小抑制浓度(MIC)或最小生物膜清除浓度(MBEC)。
【附图说明】
[0013]图1和2说明本发明的一个实施方式的微流体多孔型细胞培养测试装置。
[0014]图3是微流体孔单元的截面图。
[0015]图4是显示使用具有96孔芯片设计的细胞培养测试装置的成像步骤的示意图。
[0016]图5显示使用根据本发明的一个实施方式的细胞培养测试装置来进行抗生素易感性测试的步骤。
[0017]图6显示证明青霉素抗生素针对粪肠球菌(E.faecalis)菌株的MIC值可以使用MAC芯片快速地确定的试验结果的图像。
[0018]图7显示示出响应于抗生素的生物膜的形状的图像，其使用根据本发明的一个实施方式的MAC芯片进行研究。
[0019]图8显示在琼脂糖与革兰氏阴性细菌的溶液混合的状态下，在不同浓度的β -内酰胺抗生素的存在下革兰氏阴性细菌物种在琼脂糖中的生长。
[0020]图9是解释图8中所示现象的详解图。
[0021]图10显示在内酰胺抗生素的存在下在大肠杆菌(E.coli)菌株中图9所解释的现象的发生。
[0022]图11显示将原料引入微流体通道中以获得细菌单层的图像的步骤。
[0023]图12显示示出在细菌形成单层的状态下在不同浓度的抗生素的存在下细菌物种的生长的图像。
[0024]图13显示示出在小于MIC和大于MIC的不同浓度的作为内酰胺抗生素的氨曲南(aztreonam)的存在下铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的生长的图像。
[0025]图14和15是显示不使用抗生素时的两种细菌菌株和对抗生素具有抗性的两种细菌菌株的生长的光学显微镜图像，揭示了可以测定所述细菌菌株的双重感染。
[0026]图16是显示使用根据本发明的一个实施方式的细胞培养测试装置对哺乳动物细胞进行3D培养的图。
[0027]图17显示使用MAC芯片通过单个细胞形态分析(SCMA)测定的4种临床菌株物种的MIC值。
【具体实施方式】
[0028]以下将参照附图详细描述本发明的实施方式。但是，本发明不限于本文提出的实施方式并且可以以许多不同形式体现。相反，提供这些实施例是为了使本文充分完整，并且全面传递本发明的范围。在附图中，为了清晰可能会放大要素的尺寸，例如宽度和厚度。完全从观察者的角度解释附图。会理解的是，当提到要素“在另一要素上”时，其可以直接在其他要素上，或者其间还可以存在一个或多个中间要素。本领域技术人员会意识到可以进行许多改进和变化而无需背离本发明的主旨。整个附图中，使用相同的附图标记来实质上指定相同的要素。
[0029]另一方面，本文所用术语应该如下理解。术语“第一”、“第二”等仅用于将一个要素