一种检测宫颈癌标志物Survivin抗原表位氨基酸序列及应用
【技术领域】
[0002] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种通过生物信息学模拟筛选的具有检测宫 颈癌标志物Survivin多肤片段，人群流行病学检测验证了其检测敏感度及特异度，为进一 步用于制备宫颈癌早期诊断及预后预测试剂盒奠定基础。
【背景技术】
[0003]宫颈癌是全球女性常见的癌症之一，其发病率仅次于乳腺癌。近年来呈现地区增 长及发病年龄提前的现象。宫颈癌的病理类型、临床期别与预后密切相关。宫颈癌早期诊 断有利于患者得到及时、有效的治疗，控制疾病发展，提高女性的身体健康和生活质量。血 液学检查是最简单的微创检查手段，敏感、有针对性的肿瘤标志物对于早期诊断宫颈癌有 助于临床医生的辅助诊断，减轻患者负担，提高早期诊断率。大量研究表明，血清或血浆中 的肿瘤相关抗原能诱导机体产生自身抗体，在肿瘤患者血清中既存在肿瘤抗原，也存在针 对该肿瘤抗原的自身抗体。因此，既可W利用抗体检测肿瘤抗原，也可W利用抗原检测肿 瘤抗原的自身抗体，但利用肿瘤自身抗体检测肿瘤的特异性和敏感性均比利用肿瘤抗原检 测肿瘤要高得多。很多肿瘤相关抗原不仅在肿瘤患者体内存在，在正常人体内也存在，因此 检测肿瘤相关抗原作为诊断依据可信性差。而肿瘤自身抗体在正常人体内含量很低检测不 到或根本不存在，若体内肿瘤自身抗体水平明显增高，则表明体内存在异常免疫情况，表明 体内相关抗原水平发生波动，预示疾病的存在或原有疾病加重。
[0004] 近年来的研究表明，在恶性肿瘤体积发展到可用现代影像学技术检出之前3-5 年，患者血中可出现高浓度的肿瘤相关抗原自身抗体。因此，检测血中肿瘤相关抗原自身抗 体具有预测肿瘤发病风险和早期诊断肿瘤的重要价值。是肿瘤临床诊断领域的重点发展方 向之一。在国外已有诊断肺癌和乳腺癌的早期诊断试剂盒市售。然而，目前所报道的自身 抗体检测方法敏感度低，特异性差，假阴性比率可高达50%W上。其主要原因是由于每一种 肿瘤相关抗原自身抗体在癌症患者中的阳性检测率平均在10%左右。如何提高诊断试剂敏 感度是当前需要亟待解决的关键问题。比较行之有效的方法是寻找新的可充当肿瘤标志物 的自身抗体，然后与现有已知的肿瘤相关抗原自身抗体组合成具有敏感度高和特异性强的 诊断试剂盒。
[0005] 人类survivin基因是1997年由Ambrosini最早发现，位于染色体17q25,全长 14. 7化，由3个内含子和4个外显子组成，其编码产生的蛋白由142个氨基酸组成，相对分 子量为16. 5kD，是近年来发现的调亡抑制蛋白（inhibitorofapoptosisprotein,IAP) 家族中的一个新成员，也是目前发现的具有重要意义的调亡抑制因子之一。Survivin兼 具有抑制细胞调亡和维持细胞有丝分裂的双重功能，一般情况下在正常组织中几乎不表 达。但在病理状态下，Survivin可广泛表达于各种恶性肿瘤组织中。Survivin的过表达 会抑制肿瘤细胞调亡，促进肿瘤细胞恶性增殖，Survivin蛋白过表达与病程进展明显相关， 抑制Survivin表达被认为是一种有效缓解肿瘤的手段。在宫颈癌的研究中，研究人员发 现Survivin在宫颈慢性炎症、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中依次升高的现象。也有报道表 明Survivin是判断宫颈癌早期预后的指标，早期宫颈癌中Survivin表达显著升高，提示 Survivin在宫颈癌的诊断和预后具有重要价值。
[0006] 基于Survivin在肿瘤组织和正常组织间表达的巨大差异和其在肿瘤发展中的重 要作用，Survivin作为一个预测、预后指标和抗癌治疗祀点吸引了越来越多的关注。同时提 示我们其在宫颈癌早期诊断的应用价值较好，W及作为潜在生物标志物的可能。本发明通 过自行设计的Survivin抗原表位多肤，检测肿瘤患者血清及血浆中自身抗体水平并开发 相应的试剂，预测宫颈癌发生的危险性及预后预测，并为宫颈癌新药研究提供可靠的数据。
[0007] 本发明通过自行设计的Survivin抗原表位多肤，检测宫颈癌患者血清及血浆中 自身抗体表达水平并开发相应的试剂，预测宫颈癌发生的危险性，并为制备宫颈癌早期诊 断及预后预测试剂盒奠定基础。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是公开一种检测宫颈癌标志物Survivin自身抗体的抗 原表位序列。
[0009] 本发明同时公开了Survivin抗原表位的用途。
[0010] 本发明提供的一种检测宫颈癌标志物Survivin自身抗体的抗原表位氨基酸序列 为： H- DACT阳RMAEAGFmCPAGFmCPTE肥PD -OH其纯度 >95%，pH〉7. 0。
[0011] 本发明所述的Survivin抗原表位多肤在制备宫颈癌早期诊断试剂盒中的应用。
[0012] 本发明利用自行设计的Survivin蛋白的线性多肤，采用化ISA法检测宫颈癌患者 血清及血浆中抗Survivin蛋白的特异性自身IgG抗体。自身IgG抗体水平升高表明肿瘤 患者体内Survivin蛋白的表达量增加，预示患者可能出现原发性或继发性宫颈癌，可W预 测宫颈癌发生与复发的危险性，指导临床医生对宫颈癌的早期诊断及预后预测。
抗原抗体的结合实际上只发生在抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间，两者在空间 结构和空间构型上完全互补。因此抗原决定簇就可W代表整个蛋白与抗体结合的状态与亲 和特性。另外，W重组蛋白为抗原，要经过载体构建、转染、表达、筛选、纯化等繁琐的过程， 蛋白空间结构复杂，抗原表位不易暴露，因此抗原抗体结合的特异性差。此外，ELISA法的 高灵敏性对纯化技术的稳定性要求极高，成本昂贵。
[0014] 发明人遵循W下原则设计线性多肤抗原：①选择细胞膜蛋白表面区域；②选择不 形成a-helix的序列；③两端的肤段比中间的排列合理；④避免蛋白内部重复；⑥避免同源 性强的肤段；⑧序列中尽量避免切S和Glu，不可W有太多的Pro,但有1-2个Pro利于肤链 结构稳定，对产生特异性抗体有益。此外，该多肤抗原必须含有人类白细胞二类抗原（HLA) 系统的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DPandHLA-DQ的限制性表位。运些表位可被90% W上华人群体的HLA二类抗原系统所识别。基于W上抗原设计原