Sei单克隆抗体的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学技术领域，具体地，设及一种SEI单克隆抗体的制备方法及应 用。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcalenterotoxins，简称沈S)，是由金黄色 葡萄球菌产生，能引起人类食物中毒、呕吐腹泻、休克的重要致病因子。目前已发现的肠毒 素有23种血清型，其中沈I属于新型肠毒素，其理论分子量为24. 928KD，由729个核巧酸 构成，表达一个具有242个氨基酸残基的成熟蛋白质。据调查显示，在致病性金黄色葡萄球 菌基因型检测中，sei基因检出率高达89. 5%。基于sei基因流行的广泛性，新型肠毒素 SEI潜在威胁人类健康。因此，利用SEI单克隆抗体建立SEI免疫学检测法，对监测和预防 由SEI引起的食物中毒具有重要意义。
[0003] 传统免疫动物方法制备抗体的效率低，产量有限，并且其产生的血清多克隆抗体 为多种抗体的混合物，运种多克隆抗体与抗原反应的特异性不高，重复性低。单克隆抗体理 化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合特异性强，便于人为处理和质量控制，是免疫 学领域的重大突破。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提一种SEI单克隆抗体的制备方法，通过该方法所 制备的SEI单克隆抗体效价高、性质稳定、特异性强。
[000引此外，本发明还提供一种沈I单克隆抗体的应用。
[0006] 本发明解决上述问题所采用的技术方案是：SEI单克隆抗体的制备方法，包括W 下步骤：W重组SEI免疫BALB/c小鼠，再用小鼠的脾细胞直接与骨髓瘤细胞融合，采用间接 酶联免疫吸附法筛选产SEI单克隆抗体的优势杂交瘤细胞株，得到SEI单克隆抗体。
[0007] SEI具体是指金黄色葡萄球菌新型肠毒素I，SEI潜在威胁人类健康，因而我们需 要对SEI进行检测，普通的检测方法检测速度较慢，耗时较长，采用SEI单克隆抗体进行检 测操作简单，能够快速检测到SEI，本发明在制备SEI单克隆抗体的方法中，采用重组SEI作 为免疫原，重组SEI具有免疫原性，能够直接激发免疫细胞产生特异性抗体，具有多个抗原 决定簇，将其直接作为免疫原作用于BALB/c小鼠制备单克隆抗体，可W同时制备出多种具 有不同抗原决定簇的单克隆抗体，用于构建双单抗夹屯、化ISA方法检测毒素蛋白SEI。
[0008] 实验证明，通过本发明所述方法制备的SEI单克隆抗体效价高、性质稳定、纯度 高、特异性强、亲和力高。
[0009] 进一步地，重组SEI蛋白的制备与纯化过程为：W金黄色葡萄球菌的DNA为模版 进行PCR扩增，获得sei基因完整片段，测序后采用EcoRl和Sail分别酶切PCR产物和 pET-28a(+)，连接，筛选获得重组质粒祀T-28a-沈I，重组质粒祀T-28a-SEI在表达场所内 进行表达，表达菌株进行培养、离屯、收集细胞菌体，再将细菌菌体超声破碎，离屯、弃沉淀，上 清进行过儀琼脂糖亲和层析、阳离子交换层析纯化收集，进一步浓缩，获得纯化的SEI重组 蛋白。所述sei基因在GenBank中的accessionnumber为KT853046。
[0010] 目前，蛋白的合成主要包括人工合成多肤W及用现有DNA模板依次进行PCR扩增、 酶切、测序、质粒重组、重组质粒进行细胞表达得到细胞菌体，细胞菌体进行纯化得到重组 蛋白，其中，通过人工合成的多肤分子量小，仅有一种抗原决定簇，因此由其制备的单克隆 抗体种类单一，并且人工合成的多肤为半抗原，由于半抗原缺乏免疫原性，不能直接激发免 疫细胞产生特异性抗体，因此，必须将半抗原与小鼠钥孔虫戚血蓝蛋白化LH)和牛血清蛋 白度SA)偶联作为免疫原才能得到特异性抗体，操作麻烦，本发明的SEI重组蛋白采用的 是W金黄色葡萄球菌的DNA为模版进行PCR扩增，获得SEI的完整基因序列（accession number:KT853046)，用EcoRl和Sail分别酶切PCR产物和祀T-28a(+)、连接，筛选获得重 组质粒祀T-28a-SEI，通过本发明制备的沈I重组蛋白能直接激发免疫细胞产生特异性抗 体，并且可W同时制备出多种具有不同抗原决定簇的单克隆抗体，可W用于构建双单抗夹 屯、化ISA检测法。
[0011] 进一步地，重组的祀T-28a-SEI质粒的表达场所为大肠杆菌化21。
[0012] 进一步地，优势杂交瘤细胞株采用辛酸-饱和硫酸纯化腹水，透析后得到SEI单克 隆抗体。本发明的纯化抗体的方法操作简单，不需特殊仪器，且蛋白损失小，纯化效果较为 理想。
[0013] 进一步地，重组SEI与等量完全或不完全弗氏佐剂混合揽拌法将其乳化，乳化完 全后用于免疫BALB/c小鼠。
[0014] SEI单克隆抗体的应用，所述SEI单克隆抗体用于制备检测样品中含有SEI的试剂 条或试剂盒。
[0015] 综上，本发明的有益效果是：
[0016] 一般方法制备的单克隆抗体亲和力仅能达到1〇6,但通过本发明所述的方法制备 的SEI单克隆抗体亲和力达1〇8,说明本方法制备的SEI抗克隆抗体与抗原分子结合力更 强，可W大大提高构建SEI免疫学检测法的灵敏度；此外本发明制备的SEI单克隆抗体还具 有效价高、性质稳定、纯度高、特异性强等优点。因此，通过本发明所述的方法制备的SEI单 克隆抗体能够应用于试剂条或试剂盒，能够快速检测出样品中SEI的含量，能够用于建立 SEI的免疫学检测方法，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0017] 图1纯化的融合蛋白沈I的SDS-PAGE分析图；
[0018] 图2纯化的融合蛋白沈I的WesternBlot分析图；
[0019] 图3纯化的融合蛋白SEI的灰度分析图；图3中Rf是色谱法中表示组分移动位置 的参数；
[0020] 图4纯化的融合蛋白SEI浓度的BSA标准曲线；图4中BSA是标准的结晶牛血清 蛋白BovineSerumA化umin的缩写；OD值是光密度OpticalDensity的缩写，表示被检测 物吸收掉的光密度；
[0021] 图5纯化的沈I单克隆抗体的SDS-PAGE分析图；
[0022] 图6SEI单克隆抗体亲和常数分析图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例及附图，对本发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。
[0024] 实施例1:
[00巧]一、SEI单克隆抗体的制备：
[0026] 1、SEI重组蛋白的制备及纯化：
[0027] 1)菌株来源：采用保存的金黄色葡萄球菌（含sei基因，该基因序列已经提交到 GenBank数据库中，该基因的登录号为KT853046)。
[0028] 2)根据sei基因序列设计金黄色葡萄球菌新型肠毒素sei基因引物：
[0029] h游引物：CGTACGGAATTCATGAAAAAATTTAAATATAG化coRl)；
[0030] 下游引物：CGCTAGGTCGACTTAGTTACTATCTACATA(Sail)。
[0031] 3)质粒构建：W金黄色葡萄球菌的DNA为模版进行PCR扩增，获得sei基因完整 片段，并连接pMD嚴19-TVectoHTakara公司），进行测序。
[003引 4)表达质粒的构建：EcoRl(天根公司）和Sail(天根公司）分别酶切PCR产物 和祀T-28a(+)(天根公司），SolutionI(Takara公司）16°C连接60min，转入感受态细胞D册a(天根公司）中，37°C培养过夜，提取质粒，双酶切鉴定，获得重组质粒祀T-28a-SEI。
[0033] 5)融合蛋白表达转化：取1yL重组的祀T-28a-SEI质粒转入大肠杆菌化21，42°C 热击90s后冰上静置5min加入700yL培养基，37°C培养45min，取IOOul涂平板（30yg/ 血Kan), 37 °C培养过夜。
[0034] 6)小试培养选择最佳的诱导条件
[003引 a.挑取表达菌株化21(pET-28a-SEI)的单菌落于试管中（4mLLB培养基，30yg/ mL肪11)37°(：，220巧111过夜培养。
[003引 b.将培养的菌液按1:100比例分别接种于4mLLB培养基中，添加至30Jig/mL Kan，37 °C，220巧m培养。
[0037] C.当OD值达到0. 6左右时，分别添加终浓度为0. 5mM的IPTG，220巧m，15°C过夜， 25°C过夜，37°C诱导化，未加IPTG诱导剂的作为阴性对照。
[0038] d.收集菌体并用PBS缓冲液悬浮。
[0039] e.SDS-PAGE电泳检测，选择最佳的蛋白表达诱导条件。
[0040] 7)大量诱导
[0041] 将培养的菌液按1:100比例接种于化的LB液体培养基中，添加终浓度30yg/mL Kan, 37°C，220巧m培养，当OD值达到0. 6左右时，添加终浓度为0. 5mMIPTG，25°C，220巧m， 16h，离屯、收集细胞菌体。
[0042] 8)融合蛋白纯化：将收集的细菌菌体用破碎BuffeHSOmMTris, 300mM化Cl, 7M 盐酸脈，0. 1 %TritonX-100,PH= 8. 0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率500W，20min(超 声2s，暂停6s为一个循环）。超声完毕后，12000巧m/min，4°C，离屯、20min，弃沉淀，上清做 下步纯化。
[0043] a.儀琼脂糖亲和层析：取10血Ni-IDA,用10倍柱床体积的BindingBuffeHSOmM Tris，300mM化C1，8M尿素，pH= 8. 0)清洗平衡柱子，流速5血/min。再将样品（溶解液上 清）上柱，流速为2血/min,收集穿透液。之后用10倍柱床体积的WashBuffer(50mMTris， 300ml化Cl,SM尿素，10/20/50mM咪挫，pH= 8.0)清洗柱子，流速 2血/min。再用Elution Buffer(50mMTris，300mMNaCl，8M尿素，500mM咪挫，pH= 8.0)洗脱，流速2mL/min，收集 洗脱液。最后将含目的蛋白的洗脱组分透析到25mMTris，4M尿素，PH= 8.0的缓冲液中， 透析过夜，下一步用阳离子交换法纯化目的蛋白。
[0044] b.阳离子交换层析：取10血SP Se地arose? FF填料，用10倍柱床体积的Binding Buffer(25mM Tris，4M尿素，抑=8.0)清洗平衡柱子，流速5血/min。再将样品（溶解液上 清）上柱，流速为2血/min,收集穿透液。之后用10倍柱床体积的Wash Buffer (25mM Tris, 4M尿素，50/100/150/200/300mM化Cl, pH = 8. 0)清洗柱子，流速2血/min。再用Elution Buffer (25mM Tris，SOOmM化Cl，pH = 8.0)洗脱，流速2血/min,收集洗脱液。最后将高纯 度的洗脱液组分透析到25mM Tris, 4M尿素，pH= 8. 0的透析液中，SDS-PAGE电泳检测，最 终得到的纯化的沈I重组蛋白的SDS-PAGE分析见图1 ;SEI免疫原的蛋白纯度分析见图2， SEI蛋白纯度为87. 3%;SEI蛋白浓度采用图3的标曲进行计算，获得的SEI蛋白浓度为 1. 02mg/ml。最终的纯化蛋白透析到PBSJmM DTT，PH7. 4的缓冲液中。
[0045] 2、动物免疫：
[004引1)实验动物：选5只6~8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。小鼠注射抗原前一周， 皮下注射Img卡介苗，W增强机体对抗原的免疫应答水平。
[0047] 2)抗原处理：将SEI蛋白免疫原与等量完全或不完全弗氏佐剂混合揽拌法将其乳 化，乳化完全后皮下多点注射小鼠。
[0048] 3)免疫方法