一种永生化人肝癌血管内皮细胞系及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种永生化人肝癌血管内皮细胞系的构建、 体外培养体系、鉴定及其应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是严重危害人类健康的重大疾病，攻克癌症治愈的任务仍很艰巨。迄今为止， 虽然抗癌药物W雨后春算般的出市，但是癌症的根治问题仍未解决。研究表明，肿瘤的生长 和转移与肿瘤血管密切相关。近年来，临床上利用"饥饿疗法"配合化疗治疗癌症，就是阻 断肿瘤的新生血管使肿瘤细胞所需的营养和氧分供应缺失，从而导致癌细胞饿死。然而，祀 向血管抗癌药如贝伐单抗在目前临床应用中出现疗效不一，其原因之一可能与在药物研发 中采用的祀细胞来源于正常血管而不是肿瘤组织血管细胞有关。资料报道，肿瘤血管的生 物学特性是有别于正常血管，所W基于正常血管的祀向药物用于抗癌治疗（严格来讲）是 不精准的。
[0003] 对此，建立肿瘤血管内皮细胞模型对研发肿瘤血管祀向药物是十分必要的。既往 国内外的实验室已采用免疫磁珠法分离提取出实体肿瘤血管内皮细胞（孔令群等，人肝癌 血管内皮细胞分离培养、鉴定及比较，中华实验外科杂志，2011，28 (2) :236-238)，但是运种 方法获得血管内皮细胞的纯度不高，并且由于体外培养细胞寿命的自然极限（海弗利克极 限，Hayflicklimit,ShayJW,WrightWE:Hayflick,hislimit,andcellularageing,Nat RevMolCellBiol, 2000,I(I) :72-76),通常随着时间的推延，培养的细胞逐渐出现生 长缓慢，有丝分裂停滞，细胞渐渐衰老死亡（CampisiJ=Replicativesenescence:an oldLives'tale? ,Cell, 1996, 84:497-500)。经检索专利数据库发现，中国专利申请 CN201510143871. 3,申请公布号为CN104726408A，发明名称为"血管内皮细胞的快速提取方 法"，该专利申请也公开了用免疫磁珠法分离肿瘤血管内皮细胞的方法，包括W下步骤：用 眼科剪剪碎离体的肿瘤组织得到破碎肿瘤组织，用胶原酶和/或膜酶消化破碎肿瘤组织得 至IJ肿瘤单细胞；利用免疫磁珠法分选得到所述肿瘤血管内皮细胞。应该指出，该专利申请也 是采用"现用现取"方法获得肿瘤血管内皮细胞。迄今为止，本领域相关研究者只能采用新 鲜分离的肿瘤血管细胞作为材料，然而运种每次"现用现取"的方法都需要消耗大量的时间 作细胞性能的鉴定，运样在人力、物力、财力上都是巨大的浪费和低效。
[0004] 目前在市面上还没有一株鉴定为肿瘤血管内皮细胞系出售，运种长期W来缺乏稳 定的肿瘤源性血管内皮细胞系及其体外培养体系已构成了研究肿瘤血管生成机制W及血 管祀向药物筛选的瓶颈问题。因此，建立纯化的人肿瘤血管内皮细胞模型势在必行，特别是 获得永生化的人肿瘤血管内皮细胞更是本领域研究人员翅首W吩的。
[0005] 近年来，随着基因工程技术的发展，使体外培养细胞的有限寿命转化为无限繁殖 的永生化细胞系成为可能，其基本原理是将可持续复制的外源基因插入到基因载体，然后 转入到祀细胞（原代细胞），使该外源性基因能整合到祀细胞基因组中，从而获得稳定的永 生化细胞系。目前常用的可持续复制外源性基因有simianvirus401argeT(SV40-LT)病 毒基因，SV40-LT慢病毒转染哺乳动物细胞后可使细胞无限制繁殖即永生化转化。因此，SV40-LT慢病毒是制备永生化细胞模型的常用工具（解慧琪，杨志明，屈艺，SV40与细胞永 生化，中国修复重建外科杂志2000,14(3) :170-174)。经检索专利数据库，相关的应用可见 中国专利申请CN01130757. 9,申请公布号为CN1336431A，发明名称为"人卵巢癌永生化细 胞株的建立"，该专利申请公开了一种人卵巢癌永生化细胞株的建立方法，是将SV40T抗原 基因导入人卵巢癌原代细胞，经筛选，抗性克隆扩大培养，得到一株体外长期稳定生长和传 代的人卵巢肉瘤样癌细胞株BUPH:OVSC- 2,保藏号为NO. 0606。
[0006] 目前尚未见文献报道有关SV40相关基因导入原代人肿瘤血管内皮细胞或其他方 式建立的永生化人肿瘤血管内皮细胞株及其构建的方法和鉴定。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种永生化人肝癌血管内皮细胞系EC畑CC-1，本发明另一 目的在于提供该永生化人肝癌血管内皮细胞系EC畑CC-I的构建方法和鉴定，本发明的第 S目的在于提供该永生化人肝癌血管内皮细胞系EC畑CC-I的应用，为研究肿瘤血管生成 的调控W及血管祀向抗癌药物的筛选提供根本的物质基础。
[0008] 本发明的主要技术方案：考虑到被转染的祀细胞是原代人肝癌血管内皮细胞，常 规的转染技术（即物理介导、化学介导W及生物介导中的一些病毒如腺病毒和逆转录病 毒）对运种真核原代细胞的转染效率极低，因而很难建立稳定的转染细胞株。对此，本发明 采用慢病毒转染技术，构建SV40-LT慢病毒载体（SV40-LTLentiviralvector)(见图1)， 其中包含有SV40-LT基因（PSV40)和用于真核细胞转染筛选的抗嚷岭霉素基因（Puro)。由 于考虑到被该病毒转染的祀细胞在下一步应用中会用到带巧光报告基因（比如GFP)的转 染方法，所W构建SV40-LT慢病毒载体中没有携带GFP基因。在制备祀细胞方面，本发明采 用CD31免疫磁珠联合流式细胞仪双分选技术，高度纯化人肝癌血管内皮细胞：首先用磁珠 富集肝癌组织中血管内皮，培养传代到第6代时，采用流式细胞仪进一步纯化血管内皮细 胞。本发明的另一个创新举措是，用先进的流式细胞分选仪对经嚷岭霉素多次筛选后的活 细胞进行单细胞分选纯化，确保稳定转染的祀细胞是CD31阳性肝癌血管内皮细胞。
[0009] 本发明的第一方面，是提供了一种永生化人肝癌血管内皮细胞系EC畑CC-1，其保 藏号为CCTCCNO:C2015172,于2015年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中屯、。
[0010] 本发明的第二方面，提供了该永生化人肝癌血管内皮细胞系ECD肥C-I的构建方 法和鉴定。
[0011] 本发明的构建方法包括：
[0012] A、分离提取人肝癌（中分化）组织血管内皮细胞。
[0013] B、原代人肝癌血管细胞的培养及培养体系。
[0014] C、构建SV40-LT慢病毒载体，用该病毒转染原代人肝癌血管内皮细胞，并药物筛 选出阳性细胞。
[0015] D、用流式细胞仪单细胞模板分选，高度纯化携带SV40-LT基因的CD31阳性细胞。
[0016] 步骤A具体为：经知情同意和医学伦理批准，取人肝癌（中分化）手术切除新鲜标 本，经酶消化分解组织，制备单细胞悬液。随后进行CD31免疫磁珠分选，当细胞培养传代至 6代时，用流式细胞仪分选，进一步纯化CD31阳性血管内皮细胞。
[0017] 步骤B具体为：将步骤A获得的CD31阳性细胞悬浮在T25培养瓶含ECM完全培养 基，置37 °C，5 %C〇2, 95 %湿度的解箱中培养。ECM完全培养基：ECMW%胎牛血清+1 %ECGS+ 青霉素100单位/mL+链霉素100yg/mL。
[0018] 步骤C具体为：构建SV40-LT慢病毒载体，制备病毒，将该病毒转入纯化的原代 肝癌血管内皮细胞，在培养中加入嚷岭霉素，筛选出阳性细胞并继续传代培养。用实时定量 PCR仪检测转染细胞中的SV40-LT基因表达，确认SV40-LT已整合到祀细胞的基因组里。
[0019] 步骤D具体为：收集经多次嚷岭霉素处理筛选的SV40-LT慢病毒转染细胞，用 CD31巧光抗体染色，设置流式细胞仪抓FACSAriaII单细胞分选模板，进行CD31阳性单细 胞提取，机器自动收集细胞到含有ECM完全培养基的96孔培养板，每孔1个细胞。当细胞 培养形成单克隆后，膜酶消化制备单细胞悬液，进行CD31抗体染色，进一步用流式细胞仪 再次分析血管内皮细胞的纯化度。
[0020] 步骤D之后，本发明的构建方法还包括：传代培养、冻存、复苏。
[0021] 冻存：在细胞处于指数生长期，吸除培养瓶里的培养基，经膜酶消化制备单细胞悬 液，用冻存液（90 %的胎牛血清和10 %的DMSO)调整细胞浓度为IXlO6~2X10VmU分装1血 细胞悬液至EP管，置入冻存盒并存放到-80°C过夜，次日移入液氮。
[0022] 复苏：从液氮中取出冻存管，迅速置于37°C溫水中，将细胞悬液吸至离屯、管中， 15(K)r/min，离屯、lOmin，弃去上清液，用ECM