大肠杆菌噬菌体m13内标质控品的制备、应用和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及病原体诊断技术领域，具体设及一种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品 的制备、应用和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 随着分子生物学技术的迅速发展，W聚合酶链式反应为基础的各种分子生物学诊 断技术，因其具有特异性强，灵敏度高，重复性好，定量准确，方便快捷等优点，称为生物医 学领域内最有价值的研究手段，已经广泛应用于临床标本的检测。在DNA病毒PCR检测中， 影响实验过程的因素较多，如实验人员测定操作中的随机误差、扩增仪孔间溫度的差异、标 本核酸提取后抑制物的残留、待扩增祀核酸的浓度及试剂问题等，运些因素均可能会影响 PCR扩增的效率，进而造成结果的偏差。因此，在做核酸扩增实验时，需要有严格的质量控制 措施，即需要有特定的质控物。质控物须具备W下特点：（1)易制备；(2)在胆存和使用过程 中稳定性好；（3)无生物传染性；(4)能监控整个检测过程，结果可靠。
[0003] 传统的DNA病毒检测的内标有S种：样本中看家基因片段（We-actin为例）， 化及质粒DNA，假病毒，但运些质控品都有各自的弊端。样本中e-actin，若取样不成功直 接影响其结果的判断，虽然看家基因与目的基因为非竞争性扩增，但如果在样本中目的基 因与0 -actin的浓度相差10倍W上，直接干扰和影响目的检测片段的判断；质粒DNA虽然 稳定性好，但质粒易污染实验室。所W也不宜作为质控品对DNA进行监控；假病毒较之前面 两种，是比较理想的选择，但是其要求一定的技术支持，操作繁琐。严格的内标则是在反应 管加入含量一定含量的内标模板，通过内标含量的变化来监控整个PCR过程。
[0004] 大肠杆菌隧菌体M13是包膜蛋白包裹结构的DNA结构，与DNA病毒相似，且M13无 致病性，可快速培养。将大肠杆菌隧菌体M13作为DNA的PCR检测的内标质控品的研究具 有重要意义。
【发明内容】
[0005] 基于此，本发明的目的之一在于提供一种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的制备 方法。
[0006] 具体技术方案如下：
[0007] -种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的制备方法，包括W下步骤：
[0008] (1)宿主菌的制备：挑大肠杆菌邸2738菌种接种在固体培养基上培养；再挑取单 菌落接种至液体培养基中，扩大培养，得到含宿主菌的培养液；
[0009] (2)隧菌体M13单克隆的制备：挑隧菌体M13用双层琼脂平板培养法培养18-24小 时，再挑取单个隧菌斑至含宿主菌的液体培养基中培养20-2地，得到含隧菌体M13的培养 液；
[0010] (3)隧菌体M13的扩大培养：将步骤（1)制备的含宿主菌的培养液接种到液体培 养基中，培养4-5小时，得到细菌培养液，再将步骤（2)制备的含隧菌体M13的培养液接种 到细菌培养液中，培养过夜，取培养液离屯、，收集上清液，过滤即得到纯化的隧菌体M13悬 液；
[0011] (4)隧菌体M13的分析检测：取步骤（3)制备的隧菌体M13用巧光PCR法检测Ct 值，并用双层琼脂法测效价；
[0012] (5)隧菌体M13内标质控品的制备：用冻干稀释液将隧菌体M13悬液稀释至Ct值 为18-20,分装于离屯、管中，真空冷冻干燥，所得冻干品冷冻保存。
[0013] 在其中一个实施例中，步骤（4)所述巧光PCR法检测Ct值针对隧菌体M13的扩增 引物为沈QIDNO:4和沈QIDNO:5。
[0014] 在其中一个实施例中，步骤（4)所述巧光PCR法检测Ct值针对隧菌体M13的探针 为沈QIDNO:6。
[0015] 在其中一个实施例中，步骤（5)所述冻干稀释液为含有质量分数为0.8-1.2%的 牛血清白蛋白和体积分数为45-55 %的吐溫20的水溶液。
[0016] 在其中一个实施例中，步骤（5)所述真空冷冻干燥的溫度为-50°C，压力为 0. 2mTorr，所述冷冻保存的溫度为-20°C。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品。
[0018] 具体技术方案如下：
[0019] 一种大肠杆菌隧菌体M13内标质控品，由本发明上述制备方法制备而成。
[0020] 本发明的另一目的在于提供上述大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的应用。
[0021] 具体技术方案如下：
[002引上述大肠杆菌隧菌体M13内标质控品在DNA病原体的巧光PCR检测过程中作为内 柄质巧品的应用。
[0023] 本发明的另一目的在于提供一种DNA病原体巧光PCR检测试剂盒。
[0024] 具体技术方案如下：
[002引一种DNA病原体巧光PCR检测试剂盒，包含检测试剂和内标质控品，所述内标质控 品为上述大肠杆困隧困体M13内柄;质巧品。
[0026] 本发明提供了隧菌体M13内标质控品的制备方法，该方法制备的隧菌体M13内标 质控品可作为内标质控品在DNA病原体的巧光PCR检测中准确地监控整个实验过程，W此 可作为评判实验是否成功的标准。该制备方法中利用真空冷冻干燥技术将隧菌体M13制备 成冻干品，冻干品的性能更稳定，易保存。与现有的其它内标质控品相比，隧菌体M13作为 DNA的PCR检测的内标质控品具有很好的稳定性，易保存（冻干保存时间> 1年），方便运 输。在核酸提取中，对病原体内DNA有很好的模拟作用，由于表达产物为隧菌体病毒颗粒可 真正做到从样本处理到扩增的全程质量检测。隧菌体M13安全性高，易于体外培养，可通过 细菌培养即可获取，极为方便。
【附图说明】
[0027] 图1为实施例1中大肠杆菌隧菌体M13梯度稀释液的巧光PCR检测结果；
[0028] 图2为实施例1中大肠杆菌隧菌体M13的效价测试图；
[0029] 图3为实施例2中大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的均匀性巧光PCR检测结果；
[0030] 图4为实施例4中ADV腺病毒的巧光PCR检测结果；
[003。图5为实施例4中大肠杆菌隧菌体M13作为内标质控品的巧光PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0032] 为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，按照常规实验方法进行。
[0033] 冻干稀释液：含有质量分数为1%的牛血清白蛋白和体积分数为50%的吐溫20的 水溶液；
[0034] 样品稀释液：超纯水。
[003引实施例1 :大肠杆菌隧菌体M13内标质控品的制备
[0036] 1、宿主菌的制备
[0037] 先用接种环挑出一点大肠杆菌邸2738菌种接种在LB固体培养基上过夜培养；挑 取1移菌环细菌至IOmLLB液体培养基中，过夜培养，得到含宿主菌的培养液；
[0038] 2、隧菌体M13单克隆的制备
[0039] 取出0. 5ml的隧菌体，用LB液体培养基10倍梯度稀释，取IOOuL梯度稀释的隧菌 体菌液与300uL步骤1制备的含宿主菌的培养液混匀，静置15分钟，同4mL45°C的LB半固 体培养基混匀，然后倒入准备好的LB固体培养基（含IPTG/Xgal)中，待凝固后放入37°C培 养箱培养18-24小时。挑取单个隧菌斑至含有用步骤1的方法培养化的大肠杆菌的LB液 体培养基中，37°C，200r/min，摇菌2地，收获得到含隧菌体M13的培养液；
[0040] 3、大量隧菌体M13制备
[0041] (1)步骤1制备的含宿主菌的培养液按照1:20的体积比接种到LB液体培养基中， 37°C，200巧m震荡培养4-5小时后，得细菌培养液，按照1:20的体积比将步骤2制备的隧菌 体M13的培养液接种到上述细菌培养液中；
[0042] (2)将接种后的细菌培养液在37°C，200巧m震荡培养过夜，取培养液在1000 Og下 离屯、lOmin，收集上清液，用孔径0. 22um的膜过滤即得到纯化的隧菌体M13悬液；
[0043] 4、隧菌体M13的分析检测
[0044] 测定隧菌体M13的Ct值并辅W双层琼脂法检测隧菌体M13的效价。
[0045] 采用腺病毒核酸检测试剂盒（PCR-巧光探针法）检测隧菌体M13的Ct值，并辅W 双层琼脂法测定隧菌体M13的效价，具体操作如下：
[0046] 将待测隧菌体M13悬液按照10倍梯度稀释至IO9倍，每个梯度取50uL用于巧光 PCR检测，IOuL用于双层琼脂法培养检测。
[0047] (1)用腺病毒核酸检测试剂盒（PCR-巧光探针法）检测隧菌体M13的Ct值：
[0048]核酸提取试剂组分和浓度见下表：
[0049]
[0050] PCR扩增体系：
[0051]
[0052]
[0053] 引物和探针序列如下：
[0054]
[00巧]按常规技术进行核酸提取W及RT-PCR扩增，RT-PCR反应程序如下：
[0056]
[0057] 巧光PCR法测Ct值：取50uL各梯度的隧菌体M13悬液，用ABC法提取核酸，并用 腺病毒核酸检测试剂盒（PCR-巧光探针法）检测，即可得到一系列梯度的隧菌体M13悬液 对应的Ct值，实验结果见附图1。
[0058] (2)双层琼脂培养法测效价：IOuL隧菌体M13悬液与宿主菌培养液0. 2血混匀，然 后加入3血冷至50°C的LB半固体培养基，混匀后倒入LB固体培养基中，待凝固后37°C倒 置培养18-24小时，每一梯度设3个重复，计算隧菌斑数量；取隧菌斑在10-100个之间的平 皿平均值计算效价：效价（P化/mL)=平均隧菌斑数X稀释倍数X100。
[0059] 5、日篮园体Ml3内柄质捏品的制备
[0060] 采用冻干稀释液对瞻菌体M13悬液进行稀释，稀释成Ct值约18-20的瞻菌体M13 溶液，分装于0. 6mLEP管中，每管120uL，转入-80°c冰箱预冻过夜