十二酰氯修饰超氧化物歧化酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用聚締属控基氧化物修饰超氧化物歧化酶的制备方法，特别是设 及一种十二酷氯修饰超氧化物歧化酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 自1938年由Mann和Keilin从牛红细胞中分离提取所得，由于该酶为一种淡蓝色 的含铜蛋白，故当时命名为血铜蛋白巧巧throcuprein)，但对其生物学功能不了解。直到 1969年McCord和化idovich发现了其生物催化活性，并正式命名为超氧化物歧化酶，自首 次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD(超氧化物歧化酶）的研究 已有六十多年的历史。1969年Mccord等进一步发现了它们的生物活性，有关氧代谢的分子 生物学等方面的研究工作，可与DNA双螺旋结构学说的成就相比较。国际上，自70年代起 对SOD的研究全面展开，从种类、来源、结构、功效，直到SOD模拟化学，使得对SOD的研究达 到高潮。80年代末，国内对SOD的研究也相继开展，并且取得了很大的进步。国内学着对 SOD的研究主要集中在应用W及与应用直接相关的基础理论诸多方面，如罗勤慧、唐文霞等 采用不同配体及桥连剂合成了大量的模拟SOD化合物。同时，在应用方面SOD已进入化妆 品、食品和医药等领域。无可置疑，SOD的研究与应用有不可估量的前景。
[0003] 超氧化物歧化酶由于受到半衰期短、相对分子质量大、不易透过细胞膜、口服时易 受胃蛋白酶分解、体内特异性等因素的限制，SOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。对 SOD进行化学修饰，既能保留天然酶的活性，又能提高其稳定性，同时在耐热、耐酸碱和抗胃 蛋白酶分解等方面均有很大提高。中国专利CN101323845A和CN103805588A分别公开了月 桂酷氯修饰超氧化歧化酶的制备方法和月桂酸修饰超氧化歧化酶的制备方法，而如何进一 步提高产品活性和收率是需要解决的问题。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种十二酷氯修饰超氧化物歧化 酶的制备方法W提高十二酷氯修饰超氧化物歧化酶的活性和收率。
[0005] 本发明的技术解决方案是：一种十二酷氯修饰超氧化物歧化酶的制备方法，包括 在40~48°C的碱性条件下，用十二酷氯与超氧化物歧化酶进行酷基化反应；对酷基化反应 物过滤后取上清液I通过3~6级的溫度梯度处理，所述3~6级的溫度梯度处理为初始 溫度为40~45°C，每级溫差为5~10°C，末级处理的低溫为5~10°C，其中首级溫度梯度 处理是将上清液I由初始溫度迅速冷却至初始溫度减去每级溫差后的低溫，并保持10~ 15分钟后迅速升溫至初始溫度进行3500~4500转/分钟离屯、10~30分钟，除去沉淀取 上清液，后续每级溫度梯度处理是将前一级上清液由前一级处理后溫度迅速冷却至前一级 处理后溫度减去每级溫差后的低溫，并保持10~15分钟后迅速升溫至前一级处理的低溫 进行3500~4500转/分钟离屯、10~30分钟，除去沉淀取上清液，对末级处理后的上清液 II进行2级沉淀灭菌提纯处理得到十二酷氯修饰超氧化物歧化酶。
[0006] 所述2级沉淀灭菌提纯处理为对上清液II加入I~5倍体积的低于-10°c的无水 乙醇，充分揽拌，3500~4500转/分钟离屯、5~15分钟，弃上清液，将沉淀溶于2~5倍体 积的无菌水中，充分溶解后，重复上述操作，留取沉淀。
[0007] 所述的酷基化反应包括如下步骤：超氧化物歧化酶按照重量体积比Ig: 50~ 500ml溶于抑为8. 0~9. 2憐酸钟缓冲液中，缓慢滴加十二酷氯，超氧化物歧化酶溶液与 十二酷氯摩尔比为1 : 80~3000;充分揽拌后，滴加0.5mol/L的氨氧化钢溶液，调节超氧 化物歧化酶溶液的抑值为8. 0~9. 2,抑在30分钟内稳定不变化为止；将上述溶液放置于 40~48°C的水浴中揽拌1~1. 5小时。
[0008] 所述超氧化物歧化酶溶液的抑值为8. 8。
[0009] 本发明所的有益效果是用该方法得到的十二酷氯修饰的超氧化物歧化酶的活性 和收率都较现有技术有提高；十二酷氯修饰的超氧化物歧化酶相比超氧化物歧化酶在耐 热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。本发明具有工艺简单、周期短、收益率 高，具有较高的社会经济效益。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
[0011] 实施例1
[0012] 称取超氧化物歧化酶50g溶于5000ml的P册.5憐酸钢缓冲液中，充分溶解；向酶 溶液中缓慢滴加十二酷氯200ml，充分揽拌反应后，滴加0. 5mol/L的氨氧化钢溶液，维持酶 溶液的抑值为8.8,直至酶溶液的抑维持在8.8,抑在30分钟内稳定不变化为止，停止滴 加氨氧化钢。
[0013] 将上述溶液放置于40°C的水浴中揽拌60分钟，使酷化反应充分进行；抽滤除去沉 淀，取上清液I。
[0014] 溫度梯度处理：对上清液I进行3级溫度梯度处理，初级溫度为40°C，终极溫度为 10°C，每一级间溫度梯度差为10°C，上清液I由40°C迅速降至30°C，保持10分钟后再迅速 升至40°C，4000转/分钟离屯、20分钟，除去沉淀，再迅速降溫至20°C，保持10分钟后再迅 速升至30°C，4000转/分钟离屯、20分钟，除去沉淀，再迅速降溫至10°C，保持10分钟后再 迅速升至20°C，4000转/分钟离屯、20分钟，除去沉淀，得到上清液II。
[0015] 对上清液II进行二级乙醇沉淀灭菌：加入3倍体积的-12°C的无水乙醇，充分揽 拌，即产生白色沉淀，4000转/分钟离屯、5分钟，弃上清液，将沉淀溶于4倍体积的无菌水 中，充分溶解后，重复上述操作，留取沉淀约40g左右。 阳016] 用250ml的50mmol/LpH= 6. 2的憐酸钢缓冲液溶解沉淀，即得十二酷氯修饰的 超氧化物歧化酶溶液，冻干后得到冻干粉约30g。
[0017] 实施例2
[0018] 称取超氧化物歧化酶50g溶于8000ml的P册.7憐酸钢缓冲液中，充分溶解；向酶 溶液中缓慢滴加十二酷氯50ml，缓慢滴加，充分揽拌反应后，滴加0. 5mol/L的氨氧化钢溶 液，维持酶溶液的抑值为9. 0,直至酶溶液的抑维持在9. 0,抑在30分钟内稳定不变化为 止，停止滴加氨氧化钢。
[0019] 将上述溶液放置于45°C的水浴中揽拌80分钟，使酷化反应充分进行；过滤除去沉 淀，取上清液I。
[0020] 溫度梯度处理：对上清液I进行5级溫度梯度处理，初级溫度为45°C，终极溫度为 5°C，每一级间溫度梯度差为8°C，上清液I由45°C迅速降至37°C，保持15分钟后再迅速升 至45°C，3500转/分钟离屯、30分钟，除去沉淀，再迅速降溫至29°C，保持15分钟后再迅速 升至37°C，3500转/分钟离屯、30分钟，除去沉淀，再迅速降溫至2rC，保持15分钟后再迅 速升至29°C，3500转/分钟离屯、30分钟，除去沉淀，再迅速降溫至13°C，保持15分钟后再 迅速升至2rC，3500转/分钟离屯、30分钟，除去沉淀，再迅速降溫至5°C，保持15分钟后再 迅速升至13°C，3500转/分钟离屯、30分钟，除去沉淀