一种选择性分离苯丙氨酸生物转化液中肉桂酸及循环利用转化液的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物分离技术领域，设及一种在生物转化制备肉桂酸过程中将产物分 离并将转化液重复利用的方法。
【背景技术】
[0002] 肉桂酸，又名0-苯丙締酸、3-苯基-2-丙締酸。是从肉桂皮或安息香分离出的有 机酸。植物中由苯丙氨酸脱氨降解产生的苯丙締酸。
[0003] 肉桂酸的主要用途：a、在香精香料中的应用：肉桂酸本身就是一种香料，具有很 好的保香作用，通常作为配香原料，可使主香料的香气更加清香挥发，可作为苹果香精、樓 桃香精、水果香精、花香香精调和使用；可作为芳香混合物用于香皂、香波、洗衣粉、日用化 妆品中；b、在医药中的作用：肉桂酸可用于合成氯苯氨下酸和肉桂苯赃嗦，前者为脊椎骨 骸松弛剂和镇定剂，后者用于脑血栓，脑动脉硬化，冠状动脉硬化等病；还可用于合成治疗 冠屯、病的重要药物乳酸可屯、定和屯、痛平；C、在食品添加剂的应用：可用饮料、冷饮、糖果、 酒类等食品。利用肉桂酸的防霉防腐杀菌可应用于粮食、蔬菜、水果中的保鲜、防腐。肉桂 酸还可用在葡萄酒中，使其色泽光鲜。t在日化中的作用：酪氨酸酶是黑色素合成关键酶， 它启动了由酪氨酸转化为黑色素生物聚合体的级链反应。肉桂酸有抑制形成黑色酪氨酸酶 的作用，对紫外线有一定的隔绝作用，能使褐斑变浅，甚至消失，是高级防晒霜中必不可少 的成份之一。
[0004] 肉桂酸生产方法：肉桂酸可W通过化学工艺合成和生物法制备，工业化制备肉桂 酸主要为化学法：（1)化rkin合成法、（2)苯甲醒-丙酬法、（3)苯甲醒-醋酸法、（4)苯乙 締-一氧化碳法、（5)苯乙締-二氧化碳法、（6)苯乙締-四氯化碳法、（7)肉桂醒氧化法等。 主流工艺化rkin即W苯甲醒和醋酢为原料，在弱碱的作用下醒作为受体，乙酸酢的a-H被 夺去后W负离子的形式作为给予体，进行亲核加成，最后生成肉桂酸。化学合成方法需要大 量有机溶剂，污染环境，不利于工业化，并且运些方法或流程长，溫度高，能耗大，收率低；或 副产物多，分离纯化难，污染严重，合成出的肉桂酸可能达不到安全可食用级别，而生物法 制备的肉桂酸完全可W解决运些问题。生物法制备肉桂酸W生物制备的k苯丙氨酸为底 物，利用苯丙氨酸解氨酶催化k苯丙氨酸非氧化脱氨基生成肉桂酸和氨。利用生物催化法 合成肉桂酸可W在体外实现的肉桂酸的全生物合成，得到的肉桂酸由于其产品天然、无毒、 过程可控，成为当下肉桂酸高端产品开发应用的迫切需求，具有极大的市场空间和社会效 益。目前生物法制备研究还不是很多，其中一个因素就是肉桂酸对苯丙氨酸解氨酶具有明 显的抑制作用，生物转化率较低导致反应结束转化液中含有较高浓度的苯丙氨酸和较低浓 度的肉桂酸，寻求一种从苯丙氨酸溶液中快速有效分离肉桂酸的方法不仅有利于解除反应 中的产物抑制现象，对于生物制备肉桂酸的工业化实现同样具有重要意义。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的在于提供一种可W从全细胞催化制备肉桂酸的转化液中通过快速 简便的方法把底物和产物分离，并可将转化液和细胞重复利用的方法。
[0006] 本发明技术方案的理论基础：
[0007] 全细胞生物催化制备肉桂酸的基本方法是利用含有苯丙氨酸解氨酶活性的菌体 在碱性条件下Wk苯丙氨酸为底物，通过非氧化脱氨生成肉桂酸，并释放出氨。
[0009] 其生物转化液中主要富含有苯丙氨酸、肉桂酸和少量氨。因此，肉桂酸的快速分离 过程主要也就是肉桂酸与苯丙氨酸的分离过程。
[0010] 苯丙氨酸和肉桂酸在碱性反应条件下具有较好的溶解性，但由于肉桂酸属于弱酸 难溶性物质，在弱酸性条件下会选择性析出，通过调节抑和简单的固液分离解除肉桂酸产 物抑制，一方面直接获得純品肉桂酸，另一方面转化液中残余的苯丙氨酸由于解除了产物 抑制了继续被生物转化，从而提高了底物利用率和反应转化率。
[0011] 本发明的目的是通过下列技术措施实现的：
[0012] 一种选择性分离苯丙氨酸生物转化液中肉桂酸及循环利用转化液的方法，它包括 W下步骤：
[0013] (1)苯丙氨酸生物转化液经固液分离分别得到清液I与细胞菌体；
[0014] (2)将步骤（1)得到的清液I用酸调节抑值至4. 5,在室溫下揽拌处理至白色沉 淀析出；
[001引 做步骤似得到的混合体系经固液分离得到清液II与沉淀，沉淀经洗涂、冷冻干 燥得到肉桂酸样品；
[0016] (4)步骤（3)得到的清液II用碱调节抑值至生物转化所需抑，再与步骤（1)得 到的细胞菌体混合，继续进行生物转化制备肉桂酸。
[0017] 步骤（1)中，所述的苯丙氨酸生物转化液含有5~40g/L底物苯丙氨酸、10~ 20g/L产物肉桂酸W及苯丙氨酸解氨酶活性的细胞菌体，苯丙氨酸生物转化液pH为9. 0， 所述的含有苯丙氨酸解氨酶活性的细胞菌体为含有植物来源苯丙氨酸解氨酶的重组大 肠杆菌或重组酵母细胞口angY. ,JiangT. ,CongY. ,ZhengZJ. ,OuyangJ*.Molecular CharacterizationofaRecombinantZeamaysPhenylalanineAmmonia-Lyase(ZmPAL2) andItsApplicationintrans-CinnamicAcidProductionfromL-Phenylalanine.Appl BiochemBiotechnol. , 2015, 176:924 - 937. ]〇
[0018] 步骤（2)或（3)中，所述的固液分离方式为过滤或离屯、。
[0019] 步骤（2)中，所述的酸为盐酸或硫酸。
[0020] 步骤似中，揽拌转速100~200巧m。
[0021] 步骤（3)中，所述的洗涂为使用蒸馈水洗涂2~3次。 阳02引步骤（4)中，所述的碱为氨氧化钢或氨氧化钟。 阳02引步骤（4)中，生物转化所需抑为9. 0。
[0024] 步骤（4)中，清液II用碱调节抑值至生物转化所需抑，再与细胞菌体混合，添加 或不添加苯丙氨酸，利用原有细胞菌体循环进行多次催化制备肉桂酸。
[00巧]有益效果：本发明方法解决了现有的生物制备肉桂酸中产物抑制严重，肉桂酸产 量低和产品纯度不高的问题。本发明采用转化液适度酸化选择性沉淀分离肉桂酸方法得 到的肉桂酸产品，降低底物抑制作用并使转化液和细胞可循环利用的方法，产率最高可达 95%，产品纯度可达98%W上。该方法不仅过程简易，可大大降低提取成本，还可实现得静 息细胞和转化液多次循环利用。
【附图说明】
[0026] 图1为肉桂酸标准样品和实验样品红外色谱图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合实验室具体的实验数据进一步阐述本发明。运些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。 阳02引实施例1:
[0029] 1、称取0. 6g苯丙氨酸，放入50ml锥形瓶中，加入30ml的Tris缓冲液，盐酸 调整抑至9.0,并分别加入0. 26g含苯丙氨酸解氨酶的重组大肠杆菌【参考文献：Zang Y.,JiangT. ,CongY.,ZhengZJ.,OuyangJ*.MolecularCharacterizationofa RecombinantZeamaysPhenylalanineAmmonia-Lyase(ZmPAL2)andItsApplication intrans-CinnamicAcidProductionfro