一种表儿茶素单体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于儿茶素的制备领域，具体涉及一种表儿茶素单体的制备方法。
【背景技术】
[0002]儿茶素是茶叶中最重要的生理活性物质，约占多酚类80%，属黄烷醇类，其基本结构是α -苯基苯并吡喃，分为酯型和非酯型两类，结构上的主要区别在于氢基取代的数量和位置不同。儿茶素主要由表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和表儿茶素(EC)单体组成。儿茶素具有明显的抗衰老、防癌抗突变、降脂减肥、降低血糖、血脂和胆固醇、预防心血管疾病等药理功能，已广泛应用于食品加工、医药保健和日用化工等领域。卫生部已批准了茶多酚为我国食品添加剂。国内外研究成果表明，EC可防心血管疾病，预防癌症，抗氧化作用，具有明显的抗衰老功能，有望开发成为一种天然的护肤品。从1990开始，由于有关茶多酚/儿茶素的保健与药理功能研究的突破，不仅扩大了绿茶在国际市场上的份额，而且极大地推进了我国茶叶深加工产业的快速发展，为茶叶功能成分的研究与开发奠定了良好的产业与市场基础，目前，我国已经形成年产5000多吨茶多酚/儿茶素的产业规模。儿茶素粗品传统的提取分离工艺主要包括离子沉淀法、有机溶剂萃取法和吸附柱色谱法。由于茶叶的功能成分复杂，从茶叶中制取高纯度的表儿茶素单体具有相当难度。迄今，国内外尚未有表儿茶素(EC)单体制备方面的报道。
【发明内容】
[0003]本发明所要解决的技术问题是提供一种表儿茶素单体的制备方法，该方法简便，只使用酒精溶剂，制备周期短，成本低，符合绿色和安全的要求，表儿茶素单体的提取率及产品纯度高，适宜规模化生产。
[0004]本发明提供的技术方案是:一种表儿茶素单体的制备方法，包括如下步骤:
(1)加入纯水溶解大叶绿茶儿茶素提取物，配置成浓度为5%w/v的溶液，加入柠檬酸调节pH为4.0?5.0，制得茶汤料液，备用；
(2)按照0.025%w/v的比例，在茶汤料液中添加单宁酶，在30°C?35°C下静止酶解，间歇搅拌，得酶解液，离心过滤；
(3)将步骤(2)中过滤后的上清液通过装有吸附树脂的层析柱，并用乙醇水溶液进行分级洗脱，收集洗脱液，将所述洗脱液浓缩至16?18波美度，得浓缩液；
(4)将所述浓缩液在O?4°C温度下放置48?72h，按照浓缩液总质量0.1?0.2%的比例添加少量表儿茶素单体，对浓缩液进行结晶和重结晶，离心、干燥，得到表儿茶素单体。
[0005]对上述技术方案的进一步说明:步骤(2)中，加入单宁酶酶解，可以将表儿茶素没食子酸酯(ECG)水解成为表儿茶素和没食子酸，从而提高粗品中表儿茶素的含量，为后续树脂分离工艺提供较高含量底物，同时减少分离过程中表儿茶素没食子酸酯(ECG)的影响。
[0006]对上述技术方案的进一步限定:步骤(2)中，静置酶解时间为4-6小时，每间歇30分钟搅拌5分钟，在1000 r/min的转速下离心过滤。
[0007]对上述技术方案的进一步限定:步骤(3)中吸附树脂层析柱中的吸附树脂用量:50倍大叶绿茶儿茶素提取物重量；上柱流速:1.0 BV/h ;解吸溶剂:10%、30%和80%乙醇水溶液；三种不同浓度的乙醇水溶液的用量均为2BV ;解吸流速:1.0 BV/h，收集30%乙醇洗脱液。
[0008]对上述技术方案的再进一步限定:所述吸附树脂为ADS-8、HPD-450和HPD-450A之
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[0009]本发明所述的一种制备表儿茶素(EC)单体的方法，采用由单宁酶直接对表儿茶素没食子酸酯(ECG)进行酶解，使得表儿茶素没食子酸酯(ECG)水解为表儿茶素(EC)，成功解决了表儿茶素(EC)与酯型儿茶素(ECG和EGCG)难以分离的技术难题；同时，采用优选的吸附树脂ADS-8、HPD-450和HPD-450A可以有效分离表儿茶素(EC)与表儿茶素没食子酸酯(ECG)，对酯型儿茶素的水解产物没食子酸和其它杂质吸附率低，解决了表儿茶素(EC)与其它杂质的分离，从而成功实现了表儿茶素(EC)单体的制备。
[0010]本发明具有的有益效果:本发明方法以大叶绿茶儿茶素提取物为原料，联用酶工程技术，经过单宁酶酶解，吸附树脂柱色谱与结晶、重结晶技术，从绿茶提取物中分离纯化表儿茶素(EC纯度>98%)单体，优化了产品分离纯化工艺流程，单体提取率及产品纯度高。产品可防心血管疾病，预防癌症，抗氧化作用，具有明显的抗衰老功能，有望开发成为一种天然的护肤品。也是许多功能食品开发的重要原料，可单独或者与维生素类、天然植物成分复配应用于保健食品、化妆品等领域。本发明方法简便，制备周期短，成本低，符合环保和安全的要求，适宜规模化生产。
【具体实施方式】
[0011]实施例1
1、取大叶绿茶儿茶素提取物100克，配成2000ml儿茶素溶液，加入柠檬酸调节pH为4.0?5.0，向所述溶液中添加0.5克单宁酶，在30?35°C下酶解4小时，每间歇30分钟搅拌5分钟，将酶解液在1000 r/min条件下离心过滤；
2、将步骤I中过滤后的上清液缓慢通过装有ADS-8吸附树脂的层析柱，并分别用10%、30%,80%的乙醇水溶液依次洗脱，吸附树脂用量:50倍大叶绿茶儿茶素提取物重量；上柱流速:1.0 BV/h ;三种不同浓度的乙醇水溶液的用量均为2BV ;解吸流速:1.0 BV/h ;收集30%的乙醇洗脱液，并将所述洗脱液浓缩至16?18波美度，得浓缩液；
3、将所述浓缩液在O?4°C温度下放置48?72小时，按照浓缩液总质量0.1%的比例添加少量表儿茶素(EC)单体对浓缩液进行结晶和重结晶，然后离心、干燥得到10.25g白色固体。将步骤3得到的白色固体与表儿茶素(EC)标准品(购自美国Sigma-Aldrich公司，C15H14O6, M.W.290.27，编号:E4018，纯度彡98% (HPLC))对照鉴定并经高效液相色谱法分析检测(鉴定、检测结果为:所述白色固体，分子量为290，(-)ES1-MS m/z:289 [Μ —H]-，熔点240°C，分子式为=C15H14O6，表明所述白色固体为表儿茶素(EC)单体，而且纯度彡98%。
[0012]实施例2