一种蓝圆鯵抗氧化钙离子螯合肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于巧离子馨合肤技术领域，具体设及一种W蓝圆錢为原料制备具有抗氧 化活性的巧离子馨合肤的方法及由该方法制成的蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤。
【背景技术】
[0002] 肤-矿物离子馨合物是一种金属有机化合物，它是由矿物离子与肤通过馨合反应 制备而得的，其能够借助肤类在机体内的吸收机制提高金属离子的生物利用率，具备无机 态金属离子所没有的生理生化特性。目前，W人体必需的微量元素与肤馨合后制得的馨合 物已成为一种新型矿物离子补充剂，越来越受到人们的重视。
[0003] 同时由于特定分子量及氨基酸序列的肤类物质还具有较好的抗氧化活性，因此 肤-矿物离子馨合物不仅具有促进矿物离子吸收的活性，还可能具备较高的抗氧化等生物 活性，具有很大的研发价值。
[0004] 近年来，W食源性蛋白为原料采用酶解法制备抗氧化肤已取得了很大的进展，获 得了较多具有高抗氧化活性的肤段。但目前关于W蓝圆錢为原料制备具有抗氧化活性的巧 离子馨合肤的方法尚未见报道。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是为了提供一种蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤的制备方法。
[0006] 本发明的目的还在于提供上述蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤的制备方法制成的蓝 圆慘抗氧化巧离子馨合肤。
[0007] 本发明的第一个目的是通过W下技术方案来实现的：一种蓝圆慘抗氧化巧离子馨 合肤的制备方法，包括W下步骤：
[0008] (1)限制性酶解：取蓝圆慘，粉碎后加水，调节溫度为50~60°C，加入复合酶酶解， 酶解至水解度为12~20%，灭酶后离屯、，取上清液，得酶解液；
[0009] (2)超滤分离：将酶解液过截留分子量为1~IOkDa的超滤膜，取滤过液；
[0010] (3)凝胶层析柱分离：将滤过液通过葡聚糖凝胶层析柱，采用洗脱液洗脱，分段收 集洗脱液各组分，抗氧化性最好的组分即为抗氧化肤；
[0011] (4)肤与巧离子的馨合：在抗氧化肤中加入巧盐，调节抑值为5. 0~10. 0、溫度为 35~90°C进行馨合反应5~120min后浓缩和干燥，即得蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤。
[0012] 在上述蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤的制备方法中：
[0013] 步骤（1)中蓝圆慘和水的质量份配比优选为1:1~4。
[0014] 步骤（1)中所述的复合酶优选为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和膜蛋白酶中的两种或 全部，其用量优选为蓝圆慘总质量的0.2~0.8%。
[0015] 步骤（1)中灭酶时溫度优选为85~95°C，时间优选为10~30min。
[0016] 步骤（1)中离屯、时离屯、机的转速优选为4000~8000r/min，离屯、时间优选为15~ 40min〇
[0017] 步骤（3)中所述的洗脱液为超纯水，抗氧化性最好的组分即为抗氧化肤的确定方 式为：分段收集洗脱液各组分，同时检测收集的各组分的DPPH自由基清除率和OH自由基清 除率，根据DPPH自由基清除率和OH自由基清除率检测结果，收集DPPH自由基清除率和OH 自由基清除率最高的组分即为抗氧化性最好的组分也即是抗氧化肤。
[0018] 本发明优选采用分光光度计比色法检测DPPH自由基清除率和OH自由基清除率。
[0019] 步骤（4)中所述的巧盐优选为氯化巧或硫酸巧，其与抗氧化肤的质量比优选为 1:1 ~30。
[0020] 步骤（4)中所述的浓缩优选为真空浓缩，所述的干燥优选为冷冻干燥或喷雾干 燥。
[0021] 本发明的第二个目的是通过W下技术方案来实现的：采用上述蓝圆慘抗氧化巧离 子馨合肤的制备方法制成的蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤。
[0022] 与现有技术相比，本发明具有W下优点：
[0023] (1)本发明中的蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤具有促进巧离子吸收的生物活性，同 时具有较好的抗氧化活性；
[0024] (2)本发明中的蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤的制备工艺较为简便，产品安全，可应 用于实际生产。
【附图说明】
[0025] 图1是本发明实施例1中根据DPPH自由基清除率和OH自由基清除率检测结果， 收集DPPH自由基清除率和OH自由基清除率最高的组分B的过程。
【具体实施方式】
[00%] W下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。 阳〇27] 实施例1
[0028] 本实施例提供的蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤的制备方法，包括W下步骤：
[0029] (1)W蓝圆慘为原料，取肉绞碎，按照1:2的料水重量比加水，水溫调节至55。 同时加入木瓜蛋白酶与中性蛋白酶，酶的加入量为蓝圆慘总质量的0. 5%，酶解至水解度为 15%，85°C灭酶20min，再W转速为5000r/min离屯、25min，取上清液，得酶解液；
[0030] (2)将酶解液过截留分子量为IOkDa的超滤膜，取滤过液；
[0031] (3)将滤过液通过葡聚糖凝胶层析柱，采用洗脱液洗脱，洗脱液为水，分段收集洗 脱液各组分，抗氧化性最好的组分即为抗氧化肤； 阳0巧 （4)在抗氧化肤中加入氯化觀抗氧化肤与氯化巧质量比为30:1，抑值为6.0,溫 度为37°C，反应时间为40min的条件下进行馨合反应，得馨合物；
[0033] (5)真空浓缩馨合物，喷雾干燥得蓝圆慘抗氧化巧离子馨合肤。 W34]其中步骤（3)中对超滤液进行凝胶层析分离，条件为：填料为葡聚糖凝胶S巧hadexG-25,流动相（洗脱液）为超纯水，流速为1血/min,检测波长为214皿或280皿， 具体过程是：分段收集洗脱液各组分，同时检测收集的各组分的DPPH自由基清除率和OH自 由基清除率，根据DPPH自由基清除率和OH自由基清除率检测结果，收集DPPH自由基清除 率和OH自由基清除率最高的组分即为抗氧化性最好的组分也即是抗氧化肤，如图1、表1和 表2中所示，收集抗氧化活性最好的B组分峰（分子量在500化左右的组分）。
[0035]表1本实施例过葡聚糖凝胶Se地adexG-25后各组分的自由基清除率
[0037] 表2过葡聚糖凝胶Se地adexG-25后的各组分的分子量
[0039] 相关测定方法（下同）介绍如下：
[0040] 水解度的测定方法：水解度（％)=酶解液中游离氨基态氮含量/原料总氮含 量X100,式中：酶解液中游离氨基态氮含量采用甲醒电位滴定法测定；原料总氮含量采用 半微量凯氏定氮法测定。
[0041] 抗氧化性的测定方法： 阳0创DPPH自由基清除率的测定方法：取2血样液（各洗脱组分如A、B、C和D)，加入 0. 15mMDPPH(95 %乙醇溶解），混匀后于室溫下避光反应30min，在517皿处测得其吸光值 Ai，空白为2mL95 %乙醇溶液代替DPPH溶液，加入2mL样液混匀，在517皿处测得其吸光值 Aj,对照组为2血DPPH溶液加入2血95%乙醇，在517皿处测得其吸光值A0。对样品溶液 做梯度稀释，测定不同浓度下的自由基清除率，经线性回归后计算出自由基清除率为50% 时的浓度，即ICw值。清除率按W下公式进行计算：清除率（％) = [I-(Aj-Ai)/A。]X100%， 式中：A。为对照组吸光值；Ai为样品组吸光值;A为空白组吸光值。 阳0创 OH自由基清除率的测定方法：取0.6血5mmol/L邻二氮菲的无水乙醇溶液，先加 入0. 4mL0. 15mol/L的憐酸盐缓冲液（pH7. 40)和0.6血0. 75mmol/L的