一种基因分型检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，特别是设及一种基因分型检测方法。
【背景技术】
[0002] 目前临床实验室最常用的ABO血型的鉴定方法是血清学血凝试验和微柱凝胶实 验，另外ABO血型的基因型检测多用于正反定型不符的临床个案W及疑难血型的鉴定等。 血凝试验是指抗体和红细胞在液体介质中发生肉眼可见的凝集反应。根据操作的不同又分 为玻片法、试管法和全自动微板法。血凝学方法属于初筛方法，但对一般弱表达的ABO血样 W及凝集可疑的血样往往不能给出判读结果。微柱凝胶法（MGT)采用凝胶技术进行抗球蛋 白试验可提高试验的灵敏度和特异性。但是红细胞浓度过低或过高而离屯、不彻底、血清中 含纤维蛋白出现细胞"凝块"、细菌污染等，可能导致MGT假阴性或假阳性。针对ABO基于分 子水平的基因检测目前常见的主要是引物特异性扩增（SS巧然后凝胶电泳观察条带，但该 方法后续的凝胶电泳步骤最终需要目测观察结果，增大了人工误差的风险，并且因为开盖 电泳也增大了实验室污染的风险。
[0003] 目前HLA-B27等位基因的检测方法主要是淋己细胞毒性实验，引物特异性扩增和 流式细胞仪检测等方法。淋己细胞毒性实验的方法由于抗体亲和力较弱，效价低，易产生交 叉反应严重影响了分型结果的可靠性。引物特异扩增技术也就是传统SSP方法，虽然是基 于分子水平的分型技术，但是由于操作需要电泳观察条带来判定，操作复杂并且人为误差 大。采用流式细胞技术成本较高，需要洗板等，操作复杂，并且需要批量操作才有意义。不 适合用于疾病快速诊断的需要。
【发明内容】
[0004] 为了弥补上述现有技术的不足，本发明提出一种基因分型检测方法。
[0005] 本发明的技术问题通过W下的技术方案予W解决：
[0006] 一种基因分型检测方法，包括如下步骤：
[0007] (1)将待测基因加入PCR反应液中形成混合液并封闭在PCR反应板上进行PCR扩 增反应，所述PCR反应液中包含待测基因的扩增引物和特异性探针、W及内参照引物和内 参照探针，所述特异性探针和所述内参照探针的5'端用巧光基团标记且3'端用泽灭基团 标记，在所述PCR扩增反应前读取所述混合液的本底巧光值，在PCR扩增反应结束后读取反 应后的巧光值；
[0008] (2)将所述反应后的巧光值减去所述本底巧光值，若增值大于等于90%，则判定 所述待测基因为阳性，若增值小于90%则判定所述待测基因为阴性。
[0009] 本发明与现有技术对比的有益效果是：本发明的反应是封闭在PCR反应板上进 行，反应前和反应后的巧光值数据读取工作都在该封闭的环境中进行，PCR反应后污染的风 险被完全剔除，整个操作非常的简单、方便，通过反应前后的巧光值增值来对待测基因进行 分型，运样的定性分析剔除了SSP技术肉眼观察产生误差的可能。
【具体实施方式】
[0010] 下面结合优选的实施方式对本发明作进一步说明。
[0011] 本发明提供一种基因分型检测方法，在【具体实施方式】中包括如下步骤：
[0012] (1)将待测基因加入PCR反应液中形成混合液并封闭在PCR反应板上进行PCR扩 增反应，所述PCR反应液中包含待测基因的扩增引物和特异性探针、W及内参照引物和内 参照探针，所述特异性探针和所述内参照探针的5'端用巧光基团标记且3'端用泽灭基团 标记，在所述PCR扩增反应前读取所述混合液的本底巧光值，在PCR扩增反应结束后读取反 应后的巧光值；（2)将所述反应后的巧光值减去所述本底巧光值，若增值大于等于90%，贝。 判定所述待测基因为阳性，若增值小于90%则判定所述待测基因为阴性。
[0013] 其中，各个所述特异性探针上的巧光基团W及所述内参照探针上的巧光基团均不 同，巧光基团可W从W下群组中选择：FAM、肥X、TET、R0X、TAMRA和CY5 ;泽灭基团可W为 Dabcyl〇
[0014] W下通过更具体的实施例对本发明进行详细说明。
[0015] 实施例一：待测基因为ABO基因的01、02、B、A、A2基因型
[0016] (a)提取血样中基因组DNA
[0017] 使用德国inno-train公司的全血DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作过程按其说 明书进行。
[001引 化）设计扩增引物
[0019] 从GenBank中找出待检测的ABO基因序列，用Lasergene软件的MegAlign功能对 比序列，在ABO各种分型基因中设计通用扩增引物，然后将扩增引物放入NCBI中的Blast 进行扩增的特异性检验，W确保其只对ABO各个分型进行特异性扩增。同时设计内参照引 物。设计的通用的扩增引物和内参照引物见下表1-1，其中F表示正向引物，R表示反向引 物。
[0021] (C)PCR扩增
[0022] 为了使PCR产物更好的与探针进行杂交，本例中的PCR扩增反应采用不对称扩增， 即：下游引物的用量大于上游引物，使PCR扩增产物大部分为负链产物補应地，特异性探 针设计成正链探针，就可与该负链产物进行杂交。
[002引 （d)设计探针
[0024] 在引物的扩增区域内，设计探针，应保证探针的特异性。ABO各基因型的特异性探 针与内参照探针在5'端采用不同波长的巧光基团标记，3'端采用泽灭基团标记，W便读板 仪分别读取各自的巧光值。设计的探针如下表1-2所示：
[0026] 其中：FAM、肥X、TET、R0X、TAMRA、CY5为巧光基团，D油cyl为泽灭基团。
[0027] (e)配置PCR反应的混合液
[0028] 将待测基因加入PCR反应液中形成混合液，混合液W40y1/管分装在PCR反应板 上，每管中的混合液的基本组成如下表1-3所示：
[0029] 表 1-3
[0030]
[0032] 将PCR反应板用一面带粘性的透明封口膜封住，在该封闭环境下，读取反应前的 本底巧光值。
[0033] (f)PCR反应过程
[0034] 96 °C预变性15分钟；95 °C变性15秒，65 °C复性20秒，72 °C延伸20秒，循环30次； 72°C再延伸5分钟，随着扩增产物的增加，体系中释放的巧光基团成正相关增加，直到反应 完成，反应完成后，读取反应后的巧光值。将反应后的巧光值减去本底巧光值，若增值大于 等于90%，则判定待测基因为阳性，若增值小于90%则判定为阴性。
[003引通过不同的DNA样品采用W上实施例中的方法进行ABO基因分型，其结果如下表 1-4所示：
[0036] 表 1-4
阳039] 与现有成熟的SSP分型凝胶电泳检测判定方法同时检测435份样本，符合率为 100% (P<0. 05)，该435份样本用本发明的方法的检测结果如下表1-5所示：
[0040]表 1-5 :
[0042] 实施例一中基于特殊设计和改进的通用ABO糖基转移酶基因扩增引物和六种不 同波长的发光基团标记的探针，在一管反应体系中实现对样品的ABO基因型鉴定，该方法 做成的试剂盒是一个完整的系统，由引物、探针、反应缓冲液等组成，只需在系统中另外提 供样品和水，在反应前后分别读取巧光数值，然后进行数值比对计算即可实现基因型鉴定， 本实施例去除了传统分子生物学ABO基因型鉴定所需的电泳步骤，使整个技术操作更精 确、便捷、快速，极大地简化了人工操作的流程，从采集样品到结果可W只需要90分钟左 右，而且反应前和反应后的巧光值数据读取工作都在封闭的环境中进行，因此PCR反应后 污染的风险被完全剔除，结果也分析剔除了SSP肉眼观察产生误差的可能。
[0043] 实施例二：待测基因为HLA-B27基因
[0044] (a)提取血样中基因组DNA
[0045] 使用德国inno-train公司的全血DM提取试剂盒提取DM,具体操作过程按其说 明书进行。
[004引化）设计扩增引物
[0047]从GenBank中找出待检测的HLA-B27基因序列，用Lasergene软件的MegAli即 功能对比序列，在HLA-B27各种分型基因中设计扩增引物