用于胃癌诊断的miRNA生物标志物及检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物检测，具体设及用于人胃癌诊断的microRNA生物标志物及检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 胃癌作为全球第四大癌症，严重威胁到人类健康。世界每年胃癌新发病例近百万， 发展中国家占近2/3,其中42%发生在中国。胃癌的早期诊断与治疗对患者的病情及预后 至关重要，也是国内胃癌领域有待突破的主要研究方向。胃癌的发生发展设及多基因异常 调控、多步骤参与，最终使细胞生物学行为由正常演变为异常。当细胞行为异常是基于基因 水平发生变化时，便可引发细胞结构和功能的不可逆性改变，很大可能造成细胞癌变。
[0003] 实现胃癌的早期诊断可W大大提高患者长期生存率及生活质量。目前常用的癌症 诊断方法有病理学诊断、物理学诊断和血清学检查癌症相关标志物等，运些方法是在细胞 及其代谢物水平进行筛查，对于诊断出阳性结果的患者，体内已出现细胞癌变及癌细胞的 异常增殖，严格意义上看并非属于癌症的早期诊断。最新研究较多关注癌症的基因诊断与 治疗，基因诊断着眼于细胞基因水平的变化，在细胞形态与功能改变之前进行探索，使得癌 症的早发现与早治疗成为可能。目前胃癌的基因诊断主要有胃癌特异癌基因的检测及胃癌 相关病因检测。
[0004]MicroRNA(IIiiRNA)是最新发现的长约18-25个核巧酸的非编码小分子RNA，在进 化上高度保守，数量约占基因组的1 %，现已普遍认为miRNA与人类疾病的发生有密切的联 系，其发现为人们在基因水平认识癌症提供了新思路。MiRNA在转录或转录后水平负调控蛋 白质编码基因的表达：通过与其祀基因mRNA非完全互补或近似完全互补结合，导致mRNA降 解或抑制其翻译。人类基因组约30%的基因受miRNA调控，在细胞的生长、增殖、分化和调 亡等多方面发挥着重要的生物调节作用。研究已证实miRNA的异常调控与肿瘤形成及进展 关系密切。MiRNA的祀基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生等生物学效应的基因。随 着miRNA与癌症关系的不断深入研究，发现miRNA并不只是参与了癌症形成的初期阶段，还 设及到疾病病情变化、对药物的敏感性、患者预后等等多方面。随后基于miRNA的癌症基因 治疗顺势登上舞台，凸显出很大的研究价值。
[0005]MiRNA在胃癌中的研究显示了miRNA在胃癌诊治中的研究价值及应用前景。不少 文献已掲示了特定miRNAs在胃癌发生发展中的作用。化nLuGunLu,etal. 2005)等对 人类多种癌症中的microRNA表达做了分析，发现miRNA表达谱可用于区分诊断不同类型 的癌症。他们发现胃肠道癌症（胃癌、结肠癌等）的miRNA表达谱聚集在一起，与其它类 型癌症miRNA表达谱距离很远，可W区分癌细胞的大致来源。Xiao狂iaoB，etal. 2009) 等研究显示胃癌与正常组织中miRNA存在差异，同时发现癌症组织中miR-106a水平要高 于非癌症组织，并且miR-106表达水平的变化与肿瘤分期、肿瘤大小及分化程度等特性相 关，提示miR-106a可作为胃癌诊断及病情预测的潜在标志物。运些研究为寻找胃癌特异性 miRNA作为胃癌诊断生物标记物提供帮助。在胃癌侵袭和转移方面，Song灯ongxiSong,et al. 1999)等研究显示胃癌组织中miR-194的表达量与胃癌的侵袭程度成反比。他们发现IV型胃癌患者肿瘤组织中miR-194表达量比型的表达量低；体外侵袭实验证实转染 了miR-194模拟物的胃癌细胞株侵袭率降低，提示miRNA的表达量与癌症病情进展相关。亦 有研究显示miRNA在胃癌中的异常改变与癌症的预后相关。2009年的一项研究分析了 100 名胃癌患者miRNA表达谱，筛选出一组含7个异常miRNAs的表达谱，可作为独立预测患者 预后的相关指标，其预测率在后续的50名胃癌患者得到进一步验证狂Li,etal. 2009)。提 示对于miRNA在胃癌中的研究，有助于提供胃癌诊断、病情判断、预后评估等多方面信息。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供用于胃癌诊断的microRNA生物标志物及检测试剂盒。
[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得W实现的：
[0008] -组用于人胃癌诊断的microRNA生物标志物，所述microRNA生物标志物由如 下microRNA组成：has-miR-lOb-Sp、has-miR-lOO-Sp、has-miR-206、has-miR-155-5p 和has-miR-224-5p;所述has-miR-10b-5p的核巧酸序列如沈QIDNO.I所示；所述 has-miR-100-5p的核巧酸序列如沈QIDNO. 2所示；所述has-miR-206的核巧酸序列 如SEQIDNO. 3所示；所述has-miR-155-5p的核巧酸序列如SEQIDNO. 4所示；所述 has-miR-224-5p的核巧酸序列如沈QIDNO. 5所示。
[0009] 进一步地，所述microRNA生物标志物为人血清microRNA生物标志物。
[0010] 所述的microRNA生物标志物在筛选人胃癌的肿瘤诊断药物中的用途。
[0011] 一组人胃癌诊断用microRNA引物、探针的组合，所述microRNA引物、探针的组合 包括：has-miR-10b-5p引物、探针；has-miR-100-5p引物、探针；has-miR-206 引物、探针； has-miR-155-5p引物、探针；has-miR-224-5p引物、探针。
[0012] 进一步地，所述microRNA引物包括反转录引物、定量PCR前引物和定量PCR后引 物。
[0013] 进一步地，11日3-11111?-1013-5口的反转录引物序列如569 10^.6所示，定量口〇?前引 物序列如沈Q IDNO. 7所示，定量PCR后引物序列如沈Q IDNO. 16所示；has-miR-100-5p 的反转录引物序列如SEQIDNO.8所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO.9所示，定量 PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示；has-miR-206的反转录引物序列如SEQIDNO. 10所 示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO. 11所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示； has-miR-155-5p的反转录引物序列如SEQIDNO. 12所示，定量PCR前引物序列如SEQID NO. 13所示，定量PCR后引物序列如SEQIDNO. 16所示；has-miR-224-5p的反转录引物序 列如SEQIDNO. 14所示，定量PCR前引物序列如SEQIDNO. 15所示，定量PCR后引物序列 如沈Q IDNO. 16所示；各microRNA探针的核巧酸序列如沈Q IDNO. 17所示。
[0014] 所述的人胃癌诊断用microRNA引物、探针的组合在制备或筛选人胃癌的肿瘤诊 断药物中的用途。
[0015] 一种人胃癌的肿瘤诊断试剂盒，包括所述的miRNA引物、探针的组合。
[0016] 进一步地，所述的人胃癌的肿瘤诊断试剂盒还包括逆转录酶、缓冲液、dNTPs、 MgClz、DEPC水、Taq酶W及标准品和/或对照品。
[0017] 本发明的优点：
[0018] 本发明将胃癌与癌旁组织表达差异明显（差异表达量大于2个化Id,RT-PCR中CT 值小于 30)的 5 种miRNAhas-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-155-5p、has-miR-206 及has-miR-224-5p进行血清学表达分析，结果表明运5种miRNA在血清中稳定表达，血清 miRNA的表达与组织具有很好的一致性，has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p和has-miR-206 表达下调，has-miR-155-5p和has-miR-224-5p表达上调。运5种miRNA可W作为胃癌诊 断的生物标志物，且联合诊断的灵敏度与特异性显著高于单一miRNA诊断的灵敏度和特异 性。
【附图说明】
[0019]图 1-图 5 分别显示has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、 has-miR-155-5p和has-miR-224-5p单独用于区分胃癌样本和正常对照的ROC曲线；
[0020] 图6显示为has-miR-10b-5p、has-miR-100-5p、has-miR-206、has-miR-155-5p和 has-miR-224-5p联合用于区分胃癌样本和正常对照的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不W此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可W对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如教科书和实验指南中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022] 实施例1 :胃癌组织差异性miRNA的筛选
[002引 1对象和方法
[0024] 1. 1标本来源
[00巧]在取得患者知情同意后，收集南京鼓楼医院2013年1月-2014年1月经病理证实 为胃癌患者手术后标本8对，包括癌组织标本W及配对的距离癌组织3厘米W上范围的癌 旁组织，所有患者在术前均未接受过化疗和放疗。
[0026] 1. 2主要仪器设备
[0027]台式离屯、机：E卵endo;rfMinispin(美国化卵endo;rfcentrifuge5810R(美国）
[0028]核酸浓缩仪：E卵endo;rfconcentrator5301 (美国）
[0029] 紫外分光光度计：DU640、天平度ec