用于检测柑橘半穿刺线虫的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及农业科学技术领域，尤其设及一种用于检测相橘半穿刺线虫的引物组 合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002] 相橘半穿刺线虫（!>lenchulussemipenetrans)是相橘上重要的定居型半内寄生 线虫，广泛分布于全世界相橘产区，能引起相橘慢衰病（Citrusslowdeclinedisease)， 可造成极大的经济损失。相橘受害后一般减产30%~50%，严重时减产达100% ;福建 省5个重要相橘产区相橘半穿刺线虫果园发病率为74. 6%，发病果园病株发病率为5%~ 100% ;湖南省永州市相橘半穿刺线虫平均发生率为82. 1%，±壤中的线虫群体密度最高可 达3077条/IOOmU严重影响了相橘的产量与品质。
[0003] 相橘慢衰病的症状不易与缺肥、缺水、生长不良或其它病原引起的黄化症状区分 开，尤其是在相橘种植区的基层，常被误诊为相橘黄龙病，而进行抛荒、砍伐或挖除，对相橘 产业造成了重大的经济损失。快速、准确地诊断相橘慢衰病，对相橘半穿刺线虫的有效防控 至关重要。相橘慢衰病最主要的诊断方法就是鉴定相橘根际±壤中是否存在相橘半穿刺线 虫。
[0004] 目前，相橘半穿刺线虫的鉴定和检测方法主要包括传统的形态学鉴定和WPCR为 基础的分子鉴定。虽然PCR方法在一定程度上克服了传统形态学鉴定上的缺陷，但需要PCR 仪、凝胶电泳和成像系统等较昂贵的仪器设备、较高的检测费用和较复杂的步骤。另外，运 两种方法，都需要将线虫从待检测的±壤样品中进行分离和在显微镜下进行初步的形态观 察及挑虫等过程，既费时费力，又需要操作人员具备专业的技能和丰富的经验，不能满足快 速检测的需要，不利于现场快速检测及基层普及应用。
[0005] 环介导等溫扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)是由 Notomi等开发的一种新型恒溫核酸扩增方法，针对祀基因的6个区域设计4种特异性引物， 利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶度StDNApolymerase),在恒溫60~65°C条件下 保溫30~90min，即可实现核酸的大量扩增。产物检测可通过肉眼观察反应过程中产生的 焦憐酸儀白色浑浊沉淀，即可判断是否发生扩增反应，也可通过向其扩增产物中加入巧光 染料利用颜色变化来判定结果。由于LAMP不需要专业的仪器设备，在普通的水浴锅或简单 的恒溫器中即可完成，具有简单、快速、特异性强、灵敏度高、产物易检测、成本低等优点，已 广泛应用于病毒、细菌、真菌、寄生虫等方面的检测。
[0006] 目前还没有通过直接提取±壤DNA而快速检测相橘半穿刺线虫的LAMP方法。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种用于检测相橘半穿刺 线虫的引物组合物及在检测相橘半穿刺线虫中的应用；还提供了一种包括上述引物组合物 的试剂盒及该试剂盒在检测相橘半穿刺线虫中的应用。
[0008] 为解决上述技术问题，提供了一种用于检测相橘半穿刺线虫的引物组合物，包括 正向外引物TS-F3,反向外引物TS-B3,正向内引物TS-FIP，反向内引物TS-BIP，环引物 TS-LB，所述正向外引物TS-F3的DNA序列为SEQIDNO. 1所述的DNA序列，所述反向外引 物TS-B3的DNA序列为SEQIDN0.2所述的DNA序列，所述正向内引物TS-FIP的DNA序列 为SEQIDNO. 3所述的DNA序列，所述反向内引物TS-BIP的DNA序列为SEQIDNO. 4所述 的DNA序列，所述环引物TS-LB的DNA序列为SEQIDNO. 5所述的DNA序列。
[0009] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述引物组合物在检测相橘半穿刺 线虫中的应用。
[0010] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种试剂盒，包括上述的引物组合物、 dNTPs、DNA聚合酶和反应缓冲液。
[0011] 上述的试剂盒，优选的，所述引物组合物包括0. 5yM的正向外引物TS-F3、0. 5yM 的反向外引物TS-B3、4yM的正向内引物TS-FIP、4yM的反向内引物TS-BIP和1.OyM的 环引物TS-LB。
[0012] 上述的试剂盒，优选的，所述反应缓冲液包括200mM的Tris-肥IUOOmM的KC1、 IOOmM的（畑4) S〇4、60mM的M拆〇4、Iwt%的Triton X-100。
[0013] 上述的试剂盒，优选的，所述dNTPs的浓度为lOmM。
[0014] 上述的试剂盒，优选的，所述DNA聚合酶的浓度为8U/yL。
[0015] 上述的试剂盒，优选的，还包括显色剂，所述显色剂包括体积比为1 : 9的SYBR green I和DMSO(二甲基亚讽）。进一步优选的，所述DMSO为PCR级DMSO。
[0016] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种权利要求3或4所述试剂盒在检测 相橘半穿刺线虫中的应用。
[0017] 上述的应用，优选的，所述应用方法为： 阳0化](1)提取待检样品的上壤DNA;
[0019] 似W提取的±壤DNA为模板，利用试剂盒进行LAMP扩增得到扩增产物；
[0020] (3)检测扩增产物中是否含有相橘半穿刺线虫。
[0021] 上述的应用，优选的，LAMP扩增条件具体为：在60~65°C溫育30~90min，然后 82°C保溫5min终止反应。
[0022] 上述的应用，优选的，步骤（3)中所述检测方法为W下A、B中的一种或两种：
[0023] A:向扩增产物中加入显色剂，轻甩离屯、管后观察颜色变化，如果显示为绿色表示 检测为阳性，表明±壤样品中含有相橘半穿刺线虫，如果显示为红褐色表示检测结果为阴 性，则±壤样品中不含有相橘半穿刺线虫；
[0024] B:取扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，在紫外光下检测结果，如果显示梯状条 带，表明±壤样品中含有相橘半穿刺线虫，如果不显示梯状条带，则±壤样品中不含有相橘 半穿刺线虫。
[00巧]与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0026] (1)本发明提供了一种用于检测相橘半穿刺线虫的引物组合物，是根据相橘半穿 刺线虫rDNA-ITS的六个不同区域设计出5条引物，特异性比常规仅用两条引物的PCR方法 要强。
[0027] 似本发明提供了一种用于检测相橘半穿刺线虫的试剂盒，用于相橘半穿刺线虫 的LAMP检测，灵敏度高、特异性强。采用该试剂盒，在0. 5g±壤中对相橘半穿刺线虫的检 测灵敏度可达到0.Ol条2龄幼虫，比常规PCR的检测灵敏度高10倍。
[00測 做本发明提供了试剂盒在检测相橘半穿刺线虫中的应用，DNA提取简便快速，不 需要对待检测的±壤样品进行线虫分离和在显微镜下进行形态鉴定及挑虫等过程，直接提 取±壤DNA进行快速检测，从提取±壤DNA到获得检测结果仅需要化左右。检测快速、时 间短。
[0029] (4)本发明提供了试剂盒在检测相橘半穿刺线虫中的应用，设备简单，不需要显微 镜、PCR仪、凝胶电泳和成像系统，只需要一个简单的恒溫器或水浴锅即可完成检测，有利于 现场检测和基层应用。同时，操作简便，结果易于观察；整个操作过程不需要复杂的仪器和 设备，一般技术人员即可完成；结果清晰明显，通过不同颜色，肉眼观察即可判定结果。
【附图说明】
[0030] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0031] 图1为相橘半穿刺线虫ITS序列的LAMP引物设计示意图。
[0032] 图2为本发明实施例3中巧光检测结果图。
[0033] 图3为本发明实施例3中电泳检测结果图。
[0034] 图4为本发明实施例4中巧光检测结果图。
[0035] 图5为本发明实施例4中电泳检测结果图。
[0036] 图6为本发明实施例5中采用LAMP方法的巧光检测结果图。
[0037] 图7为本发明实施例5中采用LAMP方法的电泳检测结果图。
[0038] 图8为本发明实施例5中采用PCR方法的电泳检测结果图。
【具体实施方式】
[0039]W下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。
[0040] W下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。 阳OW 实施例1 :
[0042] 一种本发明的用于检测相橘半穿刺线虫DNA的引物组合物，该引物组合物根据相 橘半穿刺线虫ITS序列的测序结果，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计并筛 选得到，具体的的步骤如下： 阳0创（1)相橘半穿刺线虫DNA的提取：
[0044] 挑取单条线虫放入含有8 y L d地2〇和1 y L 10 X PCR Buffer (Mg2寸ree)的200 y L PCR管中，放入液氮中冷冻Imin后，置于95°C下热激2min。重复冻融5次。然后向PCR管 中加入1yL浓度为Img/mL蛋白酶K，65°C溫育15min，95°C反应lOmin，获得DNA提取液。 前述DNA提取液可直接用于LAMP和PCR反应。 柳4日]似相橘半穿刺线虫rDNA-ITS扩增：
[0046]利用线虫rDNA-ITS区的通用引物rDNAl(5 ' -TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3 ')和 rDNA2 (5 ^ -TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3 ')扩增前述DNA提取液中相橘半穿刺线虫ITS区 片段。
[0047]PCR扩增反应体系（25yL):
[0049] PCR扩增条件为：94°C预变性 4min;94°C变性 30s，52°C退火 30s，72°C延伸Imin, 35个循环；72°C延伸IOmin;4°C保存。得到PCR扩增产物。
[0050] 做测序：将步骤似中得到的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后，回收、 克隆并测序。 阳〇5U 测序结果参见SEQIDNO. 1，具体为：
[0053] 序列测定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
[0054] (4)LAMP引物设计：根据相橘半穿刺线虫ITS序列的测序结果，利用在线引物设计 软件PrimerExplorerV4设计并筛选下述LAMP引物，引物由生工生物工程（上海）股份 有限公司合成。图1为相橘半穿刺线虫ITS序列的LAMP引物设计示意图。 阳化5] 各引物序列如下：
[0056] 正向外引物TS-F3 :5 '
[0057] 反向外引物TS-B3 :5 '
[0058] 正向内引物TS-FIP:
W60] 反向内引物TS-BIP:
[0063] 本实施例的引物组合物可作为LAMP检测试剂盒的引物组合物，用于鉴定和检测 相橘半穿刺线虫。 W64] 同