因子viii和血管性血友病因子的共表达的制作方法
【专利说明】因子VlII和血管性血友病因子的共表达 发明领域
[0001] 本发明设及重组因子VIII(rFVIII)在细胞中的功能性表达并且尤其设及其在体 外和/或体内应用中自细胞的稳定表达和分泌。
[0002] 发巧背景 阳00引因子VIII(FVIII)是大的复杂糖蛋白。其合成为330kDa的蛋白，具有结构域结构A1-A2-B-A3-C1-C2,其中A和C两个结构域具有内部序列同源性并且与因子V的A和C结 构域具有约40%序列同一性。构成总序列的38%的B-结构域，与其他已知蛋白（包括因 子V的B-结构域）没有序列同一性。然而，其被广泛糖基化并且含有整个分子上的26个 天冬酷胺（脚-连接的糖基化位点中的19个。
[0004]对FVIII的生物合成的深入了解已经来自于为了生产rFVIIIW用于治疗目的对 异源细胞类型中的表达的分析。此外，对造成与因子V和VIII的联合缺陷相关的常染色体 隐性出血障碍的分子缺陷的表征掲示了FVIII的生物合成中细胞内运输的重要性（1、2)。 阳0化]rFVIII的早期研究表明，可W使B结构域缺失而不损失FVIII的促凝血活性（在 3中综述）。编码缺失B结构域的rFVIII的表达盒导致显著高于相当的全长rFVIII表达 盒的mRNA水平，从而导致更高的rFVIII蛋白合成水平。然而，分泌到培养基中的rFVIII 的水平并不相称地增加，提示细胞内相互作用限制有效分泌（4)。rFVIII共翻译地转移至 ER腔中，在那里，其折叠并组装为S级结构。运些反应通过与rFVIII的折叠中间体相互作 用的酶和分子伴侣来促进。
[0006] 在体内，在其分泌到循环中之后，FVIII立即相互作用，形成紧密的非共价复合体， 所述复合体保护其免于被蛋白水解过早清除或失活。FVIII通过A3和C2结构域中的两个 位点结合血管性血友病因子（vonWillebrandfacto;r，VWF)。在体外，已经显示，将VWF添 加到培养基中或通过用VWF表达盒转染表达rFVIII的细胞共表达，导致通过增加rFVIII 在培养基中的稳定性增加rFVnI的积累化）。已经提出，VWF促进rFVnI从细胞表面解离 并且还可W促进rFVIII的重链和轻链的双链异二聚体的组装（14、15)，然而认为其在到细 胞外部后仅与FVIII形成非共价复合体。 阳007] 整个B-结构域的缺失，导致mRNA和初级翻译产物17倍的增加，但仅导致分泌蛋 白水平的30%增加，提示ER-高尔基体转运速率降低并且FVIIImRNA的水平不限制表达 (4)。引入已知在FVIII的ER-高尔基体转运中重要的多个N-连接的糖基化位点增加分泌 的FVIII的水平，提示，ER-高尔基体转运的速率可能是限速步骤（7)。然而，由于未能正确 折叠，ER内大量的FVIII不转运至高尔基体，并且错误折叠的FVIII在邸中的积累可W导 致氧化损伤和调亡巧），提示FVIII折叠是FVIII表达中的限速步骤。
[0008] 在近期的被设计成用于研究具有各种B-结构域构建体的FVIII表达盒的效果的 研究中，还研究了针对在人中的表达对运些序列进行密码子优化的效果（8)。将人胚肾细胞 (肥K293T)细胞瞬时转导并且在7化后评价FVIII的表达。令人惊讶的是，未观察到B结构 域区域的并入的显著影响，然而观察到自密码子优化的序列的功能性FVIII表达的7至30 倍的增加。尽管蛋白二级结构主要由氨基酸序列决定，细胞内的蛋白折叠受多种因素影响： 运些包括与其他蛋白（分子伴侣）和配体的相互作用，经邸膜的转移和氧化还原条件。翻 译速率也可W影响蛋白折叠并且已经提示，密码子使用可W是调节翻译速度的机制并且因 此允许个体蛋白结构域的逐步折叠巧、10)。FVIII是复杂的多结构域蛋白，其中新生多肤 链的非连续段在=维折叠中可能相互作用。核糖体在'稀有'密码子处停滞可W因此导致 替代的折叠途径，产生改变的构象和可能错误折叠的蛋白。对于观察到的密码子优化的序 列的效果的可能解释可W是，它们允许有效翻译和跨邸膜运输，让新生FVIII多肤链正确 折叠，导致在体外和体内观察到增加的分泌的FVIII水平。
[0009]Spencer等人（16)教导了使用慢病毒载体平台W非常高的水平表达生物改造的 重组因子VIII。然而运是通过产生嵌合FVIII序列实现，所述嵌合FVIII序列仍然包括 12%猪序列，并且运样所述FVIII不是天然的或人序列。就其使用而言，运可W引起监管问 题，因此运可能是不需要的，尤其在人的情况下。 W10] 发巧概沐
[0011] 本发明是基于发明人关于细胞中缺失B结构域的度DD)rFVin表达和尤其是密码 子优化的rFVIII进行的研究。
[0012] 本发明是基于本发明人进行的工作，所述工作是针对提供适用于动物和人试验和 治疗应用的哺乳动物版本、尤其是人FVIII的高产率生产，其是基于在体外或体内转染到 例如哺乳动物细胞中的密码子优化的化学合成的基因的使用。
[0013] 本发明人观察到，转染有苍鼠密码子优化的缺失B结构域的重组FVIII度DDFVIII coop)的哺乳动物细胞不能在一段时期保持存活，并且因此不能W有用的量稳定获得所 述抓DFVIIIcoop。然而，通过将抓DFVIIIcoop与类似苍鼠密码子优化的VWF共表达， 可W获得稳定转染的细胞，其在很长的一段时期内保持存活并且由其可W观察到高水平的 B孤FVIIIcoop表达。Kaufman(S)提示，VWF与rFVIII的共表达导致rFVIII的细胞外稳 定性，但未提示VWF与抓DFVIIIcoop的共表达可W帮助维持细胞存活性，W及抓DFVIII coop的功能性存活。
[0014] 在第一个方面，提供哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含外源引入的能够重组 表达FVIII的核酸，其中编码所述FVIII的核酸或其部分已被密码子优化W用于由所述哺 乳动物细胞表达；并且其中所述细胞还共表达血管性血友病因子（VWF)。
[0015] 在优选的实施方案中，表达VWF的核酸在能够重组表达FVIII的核酸之前被引入 哺乳动物细胞中。
[0016] 在优选的实施方案中，VWF多核巧酸序列也可WW与FVIII序列相似的方式密码 子优化。因此，尽管说明书的其余部分尤其设及FVIII的密码子优化和表达，但运不被认为 是限制性的并且可WW类似的方式扩展至VWF。
[0017] 设及的哺乳动物FVIII优选为人FVIII，但可W是来自另一种灵长类或其他哺乳 动物的FVIII，如来自小鼠、大鼠、苍鼠、兔、苍鼠、狗、马、牛、猪、绵羊、骆驼、猫、豚鼠等的 FVIII。FVIII可W是本领域中已知的修饰的版本，例如缺失B结构域的版本抓DFVIII。
[0018] 哺乳动物宿主细胞可W是任何适于表达密码子优化的FVIII的细胞并且可W例 如是人、小鼠、苍鼠、大鼠、猴、兔或狗来源的。自然地，FVIII或其修饰的版本将如本领域中 已知和在下文进一步描述的被密码子优化，W便被适当地密码子优化W用于在选择的细胞 中表达。例如如果细胞是苍鼠来源的，则编码FVIII核酸的序列将对于苍鼠表达进行密码 子优化。可W适于表达的细胞系包括肥K293,C册，3T3,BHK，MICK,Varo,化nket，Hela，W及本领域中已知的运些细胞的衍生物。
[0019] 尽管所述核酸可W对于在特定哺乳动物细胞中表达进行密码子优化，所述氨基酸 序列可W与来自相同或不同物种的FVHI-致。在优选的实施方案中，FVHI氨基酸序列对 应于人FVIII序列或其片段。在优选的实施方案中，适当的人或其他动物FVIII片段包括 B结构域缺失，并且任选地被富含天冬酷胺连接的寡糖的短B-结构域间隔区替代的FVIII 序列。优选的缺失B-结构域的FVIII氨基酸序列在图1中显示。当对于在苍鼠，如CHO或 BHK细胞中表达进行密码子优化时，运样的序列在图2中显示。
[0020] 在某些实施方案中，本发明提供或使用分离的多核巧酸，所述多核巧酸包含编码 与图 2 中所示序列至少 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或 99%相同的 多肤的核酸片段，并且其中所述核酸片段编码或是密码子优化的FVIII的变体，如图1所示 的人FVIII。人密码子优化的编码区可W通过本文所述的任意方法优化。
[0021] 通常将所述核酸构建到表达载体中，所述载体能够在适当条件下表达所述重组 FVIIIo
[0022] 方便地，密码子优化的核酸序列最初可W化学合成，而不是被克隆和诱变而产生 需要的密码子优化。根据本发明，可能产生大量的重组哺乳动物FVIII和其变体，运是到 目前为止使用之前描述的技术所不可能的。通常，本发明的方法可W生产至少〇.5mg重组 FVIII(或其变体）/升培养基，如至少Img，5mg，IOmg,