活率仅为20%左右，而转Lc3919基因植株的存活率则可提高为40%左右，是野生 型拟南芥存活率的2倍。可见，本发明所提供的Lc3919可用于农作物与重要畜牧草所需的 抗寒新品种的培育与鉴定，具有较高的应用价值。本发明在农业、畜牧业及绿色清洁能源等 领域具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0055] 图1为羊草总RNA的电泳图谱。泳道1-泳道3为三个重复，每个泳道中的两个条 带从上到下依次为28SRNA和18SRNA。
[0056] 图2为Lc3919基因的5'RACEPCR扩增产物电泳图。其中，泳道Μ为Trans2KPlus DNAMarkerDNA分子量标准（北京全式金生物技术有限公司）的DNA分子量标准；泳道1 为5'RACEPCR扩增产物。
[0057] 图3为Lc3919基因的3'RACEPCR扩增产物电泳图。其中，泳道Μ为Trans2KPlus DNAMarker(北京全式金生物技术有限公司）的DNA分子量标准；泳道1为3'RACEPCR扩 增产物。
[0058] 图4为Lc3919基因全长cDNA的PCR扩增结果。其中，泳道Μ为Trans2K Plus DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司）的DNA分子量标准；泳道1为PCR扩增产物。
[0059] 图5为Lc3919基因基因组序列的PCR扩增结果。其中，泳道Μ为Tnms2K* Plus II DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司）的DNA分子量标准；泳道1为基因组序列 扩增产物。
[0060] 图6为1x3919基因在低温胁迫（4°C)条件下的相对表达量分析。其中，将Oh时 Lc3919基因的表达量设定为1。
[0061] 图7为Lc3919基因在不同组织中的表达量分析。其中，将穗中Lc3919基因的表 达量设定为1。
[0062] 图8为转入pMDC45空载体的烟草表皮细胞的激光共聚焦/TIRF显微镜图。其中， A为荧光下的烟草叶片表皮细胞；B为明场下的烟草叶片表皮细胞；C为A与B的叠加。
[0063] 图9为转入重组表达载体pMDC45-Lc3919的烟草表皮细胞的激光共聚焦/TIRF显 微镜图。其中，A为荧光下的烟草叶片表皮细胞；B为明场下的烟草叶片表皮细胞；C为A与 B的叠加。
[0064] 图10为含有重组表达载体pK7WG2D-Lc3919的菌液的PCR鉴定结果。其中，泳道Μ 为Trans2KPlusDNAMarker(北京全式金生物技术有限公司）；泳道1为pK7WG2D-Lc3919 质粒条带。
[0065] 图11为重组表达载体pK7WG2D-Lc3919转化农杆菌的PCR鉴定结果。其中，泳道 1-3为三个重复；泳道Μ为Trans2KPlusDNAMarker(北京全式金生物技术有限公司）。
[0066] 图12为转Lc3919基因拟南芥植物基因组PCR检测结果。其中，泳道1-10表示不 同的Col-0/pK7WG2D-Lc3919株系，泳道Ck表示未转基因的野生型拟南芥植株对照，泳道Μ 为Trans2KPlusDNAMarker(北京全式金生物技术有限公司）。
[0067] 图13为T3代转Lc3919基因拟南芥的抗寒性检测结果。其中，a为野生型（WT) 与转Lc3919基因拟南芥株系（7-6、12-2和16-6)未进行处理前生长状态；b为野生型与转 Lc3919基因拟南芥株系处理后恢复7-10d后生长状态。
【具体实施方式】
[0068] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0069] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0070] 实施例1、羊草抗寒相关基因Lc3919全长cDNA序列及基因组序列的获得
[0071] -、羊草抗寒相关基因Lc3919的5'端序列的克隆
[0072]1、植物材料处理及总RNA的提取
[0073]以羊草（Leymuschinensis(Trin. )Tzvel.)品种中科 2 号（记载于"XXLi,SL Hou，QGao,etal.LcSAINl,anovelsalt-inducedgenefromsheepgrass，confers saltstresstoleranceintransgenicArabidopsisandrice.PlantandCell Physiology，2013, 54 (7)，1172-1185" 一文，公众可从中国科学院植物研究所获得）幼苗为 材料，低温胁迫（4°C)处理12小时后提取总RNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图 1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28SRNA和18SRNA，表明 获得了纯度较高、较完整的总RNA。
[0074] 2、羊草抗寒相关基因Lc3919的5'端序列的克隆
[0075] 以步骤1提取的经寒胁迫处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司 的5'RACE试剂盒（产品目录号：634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成5'端cDNA模 板。反应体系（1〇μ1) :1μ1RNA，lyl5'-CDSprimerΑ，1μ1SMARTIIAoligo，lyl DTT(20mM)，lyldNTPMix(10mM)，lyl反转录酶MMLV，2μ15XFirst-StrandBuffer, 2以1!120(所述5'-003。1'；[11161八、3麻1?1'11401丨80、5\?;^81：-31:抑11(1131^€61'等组分均 为随试剂盒提供）。反应条件：70°C2min，冰上2min，42°C1. 5h，72°C10min。
[0076] 根据本实验室454转录组测序结果，筛选出与胁迫相关的基因序列，设计引物，具 体的引物序列如下：Lcl:5^ -CCGATGAACCTCTCCGTGTTGGCA-3'(序列 2 的第 637-660 位的 反向互补序列）。
[0077] 以上述合成的5'端cDNA为模板，引物Lcl与引物UPM(Clontech公司： Long(0. 4μM) :5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，Short(2μM): 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）配对进行PCR扩增。PCR反应体系（50μ1): 1μ150XAdvantage2PolymeraseMix, 34. 5μ1PCR-GradeWater, 5μ110XAdvantage2PCR Buffer，1μ1dNTPMix(lOmM)，5μ1UPM，1μ1 引物Lcl，2· 5μ1cDNA模板（所述 5〇XAdvantage2PolymeraseMix、PCR-GradeWater、Advantage2PCRBuffer等组分 是Clontech公司，产品目录号为639206的试剂盒中的成份）。反应条件为：94°C30s， 68°C30s，70°C60s，共 35 个循环；最后 70°C延伸lOmin。
[0078] 反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，经 PCR扩增获得了长度约为680bp的目的片段。回收并纯化5'RACE产物，将其连接到pMD-18T 载体（Takara公司）上，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞（北京全式金生物技术 有限公司），筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表 明，该片段的长度为660bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3 (序列2的前660位） 所示。
[0079] 二、羊草抗寒相关基因Lc3670的3'端序列的克隆
[0080] 以步骤一提取的经寒胁迫处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Clontech公司的 3'RACE试剂盒（产品目录号：634914)并参照试剂盒说明书，反转录合成其3'端cDNA。反 应体系（10μ1) : 1μ1RNA，1μ15,-CDSprimerA，1μ1DTT(20mM)，1μ1dNTPMix(10mM)， 14 1反转录酶丽1^，2以15\?;^81：-31:抑11(1131^€61'，3以1!120。（所述5，-003。1'；[1116『八、 SMARTIIAoligo、5XFirst_StrandBuffer等组分随试剂盒提供）反应条件：70°C2min, 冰上 2min，42°C1.5h，72°C10min。
[0081] 根据上述步骤一获得的Lc3919基因5'端cDNA序列（序列3)设计引物：Lc2 :5' -GGTGCCTGCCTTTGTGGCGAGTAAT-3'（序列 2 的第 415-439 位）。
[0082] 以获得的3'端cDNA为模板，引物Lc2与引物UPM(Clontech公司： Long(0. 4μM) :5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，Short(2μM): 5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'）配对进行PCR扩增。PCR反应体系（50μ1): 1μ150XAdvantage2PolymeraseMix,34. 5μ1PCR-GradeWater, 5μ110XAdvantage2PCR Buffer, 1μ1dNTPMix(lOmM)，5μ1UPM，1μ1 引物Lc2, 2· 5μ1cDNA模板（所述 5〇XAdvantage2PolymeraseMix、PCR-GradeWater、Advantage2PCRBuffer等组分 是Clontech公司，产品目录号为639206的试剂盒中的成份）。反应条件：先94°C30s， 68°C30s，70°C60s，共 35 个循环；最后 70°C延伸 10min。
[0083] 反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，经 PCR扩增获得了长度约为600bp的目的片段。回收并纯化3'RACE产物，将其连接到pMD-18T 载体（Takara公司）上，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞（北京全式金生物技术 有限公司），筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表 明，该片段的长度为553bp，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4 (序列2的第415-967 位）所示。
[0084] 三、羊草抗寒相关基因Lc3919全长cDNA序列的获得及PCR检测
[0085] 利用上述步骤一和步骤二获得的长度为660bp(序列3)和553bp(序列4)片段之 间的重叠区，借助Contig软件