一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞及生物工程领域，具体是一种脐带间充质干细胞的分离培养方 法。 技术背景
[0002] 间充质干细胞最初在上世纪70年代采用贴壁培养方法从骨髓中分离出来。后来 人们经过研究发现，这种细胞具有多向分化潜能，在一定的诱导培养条件下能分化成为成 骨细胞，软骨细胞，脂肪细胞，心肌细胞等，这些细胞经过体外长期培养和多次传代后依然 能保持分化潜能。由于其能够分化成为多种中胚层来源的间质细胞，故称之为间充质干细 胞（Mesenchymalstemcell,MSC)。随着研究的深入人们发现，间充质干细胞不仅具有多 向分化潜能，还具有一定的疾病治疗潜能。目前在许多动物实验中已经发现，将间充质干细 胞移植到疾病小鼠模型后，疾病症状能得到明显改善，其中包括中风，脊柱损伤，帕金森等 疾病。除动物实验外，在一些临床治疗中也发现间充质干细胞对糖尿病，干硬化，心肌梗死 等疾病具有一定的疗效。早期用于临床治疗的间充质干细胞主要来源于骨髓，但骨髓中的 间充质干细胞含量较低，扩增时间较长。而且骨髓提取会对病人造成一定的痛苦，且在进行 细胞分离时，并不是每一次都能成功。上世纪90年代人们又从脐带组织中分离出间充质 干细胞，经过研究发现脐带间充质干细胞符合国际细胞治疗协会（internationalsociety forcellulartherapy，ISCT)对间充质干细胞的定义。脐带间充质干细胞能够贴壁生长， 高表达⑶73,⑶105,⑶90等阳性细胞表面标志物，几乎不表达⑶34,⑶45,HLA-Dr等阴性 细胞表面标志物。除此之外，脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞十分相似，也对多种疾 病具有一定的治疗效果，另外，脐带间充质干细胞还具有其自身的优势1 :其免疫源性低， 移植后几乎不发生免疫排斥反应。2 :其来源广泛易于采集，采集产后的胎儿脐带组织即可， 并且不会对胎儿造成伤害。3:其细胞起始量大，且易于增殖和培养，培养周期短。脐带间 充质干细胞还具有促进和恢复造血的作用，其与造血干细胞共移植也展现了良好的治疗作 用。脐带间充质干细胞的分离培养对其后续的研究与应用十分重要。本发明采用多酶消化 法，对脐带组织进行消化，消化后收集细胞沉淀进行培养。
[0003] 目前对脐带间充质干细胞的分离方法主要分为两种，即组织贴壁法和酶消化法。 组织贴壁法的优点是脐带组织块未经过酶解处理，组织仅被机械方式粉碎，细胞受到的伤 害较小。但组织贴壁培养法的一大缺点就是，细胞爬出的速度慢，原代培养时间长，细胞培 养往往成为其进行科学研究和应用的限速环节。而采用酶消化的方法，将组织中的细胞 消化下来培养就可以缩短原代培养时间。目前在一些专利文件中已经采用了酶消化的方 法来分离脐带组织，如专利CN201510135941. 0,CN201510120264. 5,CN201010605542. 3， CN200910195922. 1和CN201010125235. 5。在这些专利中，主要采用一种类型的胶原酶 消化脐带组织，其中也有结合透明质酸酶，胰酶或中性蛋白酶共消化。然而这些方法的 一个主要缺点就是消化时间长，都不少于3小时，且脐带组织用量多，亦有组织块消化 不充分的现象。在专利CN200610067537. 5,CN200810052286. 2,CN201010517717. 5 和 CN201510135941. 0中，都有用到胰蛋白酶消化脐带组织。而胰蛋白酶是一种没有组织特异 性，且活性极强的一种消化酶，任何蛋白质都是它的作用底物，也包括细胞膜表面的各种蛋 白质。所以采用胰蛋白酶消化组织，会对细胞造成较大的伤害。因此在对组织进行酶消化 时，对消化酶的选择也十分重要，应尽量能将组织消化充分，又对细胞伤害较小，相比之下， 胶原酶，中性蛋白酶，透明质酸酶是较理想的选择。
[0004] 研究发现脐带组织胞外基质主要包括胶原蛋白和糖胺聚糖。其中含有 i_歷:麵、ιν型和_型等多种胶原蛋白，以?:型和灘型为主。脐带中大部分糖 胺聚糖是透明质酸。根据脐带中的这些成分组成，宜采用胶原酶，透明质酸酶以及其它作用 较温和的酶进行消化。针对脐带中含有胶原蛋白的类型，本发明采用?:型、iv型胶原酶、透 明质酸酶，结合accutase或中性蛋白酶对脐带组织进行消化。?型，?女型胶原酶，透明质 酸酶消化细胞外基质中的胶原蛋白和透明质酸等成分，中性蛋白酶消化细胞外基质中的纤 连蛋白同时也消化型胶原蛋白，并不对细胞造成伤害，Accutase的作用较温和，具有辅 助消化作用，且对细胞伤害较小。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，解决现有技 术存在的缺陷，本发明所述技术方案包括步骤： A) 样本采集和细胞分离培养： A1)严格在无菌条件下采集产后足月胎儿的脐带组织，放入含有添加了 80-100U/ml青 霉素和80-10(^g/ml链霉素培养基的无菌容器，0-4°C运输，运输过程中确保脐带组织完全 浸没在培养基溶液液面以下，48小时内对脐带组织进行处理； A2)将脐带中的胶体组织收集到离心管或培养皿中，用剪刀或组织破碎仪将胶体组织 破碎成组织块； A3)量取胶体组织块到一个新的无菌器皿中，加入消化液在35-37Γ恒温振荡器中振荡 孵育50-80分钟，振荡频率为40-60rpm; A4)向步骤A3)中消化后得到的混合液中加入1-3倍体积的缓冲液稀释，充分混均后， 转移并离心，弃上清液； A5)向沉淀中加入缓冲液洗涤细胞，再次离心，弃上清液； A6 )向沉淀中加入生长培养基，充分吹打混匀后接种于贴壁培养皿中，放置培养箱中进 行原代细胞培养，每二-三天换培养液； B) 传代培养：原代细胞经过培养，待细胞融合度达到80%以上，继续传代培养； C) 生长曲线绘制：待第二代脐带间充质干细胞融合度达到80%以上，将细胞消化好，并 终止消化，充分吹打混匀，离心弃上清液；用培养基重悬细胞后计数，将细胞悬液加入多孔 板进行培养、检测；将检测结果绘制成脐带间充质干细胞生长曲线； D) 细胞检测：采用第三代细胞进行检测，准备消化好的第三代代脐带间充质干细胞，缓 冲液洗涤后对细胞进行抗体标记经孵育洗涤后，进行检测。
[0006] 2、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是，还包 括步骤： E)成骨和脂肪细胞分化：采用第三代代细胞进行成骨和成脂细胞分化。
[0007] 3、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：所述A 步骤中的消化液含〇. 8-1.Omg/mlI型胶原酶，0. 2-0. 3mg/mlIV型胶原酶，1-1. 5U/ml分散 酶，8-l〇Pg/ml透明质酸酶；其中lU/mldispase可用30%体积比的细胞消化液代替。
[0008] 4、如权利要求1所述的脐带组织间充质干细胞的分离培养方法，其特征是：所 述D)步骤标记的抗体分别是PE-CD73,PE-CD105,PE-CD90,PE-CD34,FITC-CD45, FITC-HLA-Dr,PE-CD44,PE-MouseIgGl和FITC-MouseIgGl〇
[0009] 本发明与现有技术相比，具有如下优势： 同时使用两种类型的胶原蛋白酶(?:型和型)，透明质酸酶结合中性蛋白酶或accutase对脐带组织进行消化（目前已有的专利文献对于胶原酶仅使用其中一种，也未使 用accutase)。本发明的优点是该酶组合液与其它专利相比消化时间短，仅需要1小时。消 化充分，组织炔基本被消化完，组织块利用率高。使用2. 5ml脐带组织消化后，经过7-8天 培养可获得约2. 5X105个原代细胞。
【附图说明】
[0010] 图1a原代脐带MSC细胞形态 图lbP1代脐带MSC细胞形态 图1cP3代脐带MSC细胞形态 图1dP5代脐带MSC细胞形态 图2P3代脐带MSC生长曲线 图3P3代脐带MSC流式检测结果，CD73,CD105,CD90,CD44和CD29阳性率大于95%，CD34,CD45和HLA-Dr阳性率小于2% 图4aP3代脐带MSC向成骨细胞分化结果，细胞表面已经被茜素红s染色液染成深红 色，说明细胞表面已经形成钙化结。
[0011] 图4bP3代脐带MSC向脂肪细胞分化结果，在细胞内部已经形成大量脂肪滴，并 被油红氧染成红色。
[0012] 图5对比实验结果，a、b、c和d分别为用本发明方法消化0. 5h、lh、2h和3h，所 获得的细胞数量分别为〇. 9X105个、2. 5X10 5个、1. 6X10 5个和1. 2X10 5个；e和f分别为采 用专利CN200910055219. 0实施例3和专利CN201010605542. 3实施例1的方法消化组织块 lh，所获得的细胞数量分别为0. 9X105个和0. 6X10 5个。
【具体实施方式】
[0013] 为了便