海岛棉GbHyPRP1基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因启动子，具体地说，涉及海岛棉GbHyPRPI基因启动子。
【背景技术】
[0002] 棉花不仅是最重要的纤维作物，还是重要的经济作物，其生产对全球经济有着巨 大的影响。人类植棉的历史可追溯至5000~10000年前。目前，全世界有超过80个国家 进行棉花的商业化种植，如中国、美国、印度、澳大利亚等。中国是全球最大的皮棉生产国与 消费国。全球约1亿个家庭从事与棉花相关的产业，每年产值约1000亿美元。
[0003] 作为主要栽培种的陆地棉是黄萎病（Verticilliumwilt)菌的重要寄主之一。通 常，黄萎病能够造成10%~20%的棉花产量损失，严重时超过60%。目前，对于该病尚无 有效的杀菌剂。随着棉花基因组测序工作的完成，解析棉花抗黄萎病的分子机制，挖掘抗 病基因和能激发植物免疫反应的相关基因，并通过基因工程技术改良棉花品种黄萎病抗 性对防治棉花黄萎病的发生不失为一种有效的措施。HyPRP蛋白在植物应对多种生物和 非生物胁迫中显示重要功能。来源于玉米（Zeamays)的ZmHyPRP基因受ABA(abscisic acid)诱导和盐胁迫而表达下调，但是受冷胁迫却是表达上调；草莓（Fragariaxananassa cv.Chandler)的FaHyPRP基因在果实中特异表达，并受生长素调节；Zhang等发现敲除 AtHyPRP(EARLIl)基因将降低拟南芥（Arabidopsisthaliana)对寒冷的抵抗；随后的试 验又发现EARLI1基因能够在低温下促进发芽以及提高植物的耐盐性，更重要的是EARLI1 重组蛋白显示出对灰霉菌（Botrytiscinerea)和尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum)的 抑制作用。来源于甜椒（Capsicumannuum)和烟草（Nicotianabenthamiana)的HyPRPs 蛋白被证明在植物根部的表达量最高，并且在叶片中过量表达可引起细胞程序化死亡 (programmedcelldeath，PCD)和过敏反应（hypersensitiveresponse，HR)，而水杨酸 (salicylicacid,SA)、茉莉酸甲酯（methyljasmonicacid,MeJA)和乙稀（ethylene，ET) 等信号分子能够诱导HyPRPs基因下调表达，由此说明该基因负向调节植物抗病性。法国 菜豆（Phaseolusvulgaris)在受到病原菌侵染后，PvPRP表达量显著下调，而在受到机械 损伤后表达量显著上调，因而认为该蛋白在植物免疫中起到负调控作用，同时具有高效表 达修复细胞壁损伤的功能。对苜蓿（Medicagofalcata)中的HyPRP研究显示，其表达可 受多种环境胁迫影响，特别是对于低温和干旱，且HyPRP表达可能受一氧化氮信号分子调 节。来源于野生番前（LycopersiconesculentumMill.cv.Castlemart)的一个HyPRP被 命名为LepreproHypSys，它除了参与构成细胞壁，还可在植株受到伤害（机械的和病原菌 的）后分解成3个多肽（LeHypSysI，II，和III)，这些小肽能够起到类似肽激素（p印tide hormones)的功能，即激活植物免疫反应。
[0004] 目前，棉花上已报道的HyPRP基因有5个，包括许文亮等从陆地棉胚珠和纤维CDNA 文库中分离的GhHyPRPl和GhHyPRP2。RT-qPCR分析显示GhHyPRPl在幼苗下胚轴中大量表 达，而GhHyPRP2在胚珠中优势表达，暗示它们可能分别在棉花下胚轴伸长以及胚发育过程 中发挥作用。GhHyPRP3在棉花花瓣中表达量丰富，但当植物受到盐或低温胁迫时，其在根中 的表达会显著升高；此外，该基因受赤霉素（gibberellicacid，GA)诱导时表达显著下调。GhHyPRP4是分离自陆地棉的又一HyPRP基因，编码一个由122个氨基酸残基组成的蛋白，对 于植物抗寒显示出潜在的作用。来自于海岛棉的GbHyPRPl参与棉花抗黄萎病的过程，且是 一个重要的负调控因子。基因的有效转录和表达是发挥其基因功能的重要条件，基因成功 转录和表达需要依靠启动子对其调控。然而，在本发明的研究之前，尚无棉花HyPRP蛋白基 因启动子及其调控元件的报道。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种海岛棉GbHyPRPl基 因启动子及其应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0007] 第一方面，本发明提供海岛棉GbHyPRPl基因启动子，其核苷酸序列如SEQIDNo.1 所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序 列的由SEQIDNo.1衍生的核苷酸序列。
[0008] 第二方面，本发明提供含有前述启动子的基因序列，其核苷酸序列如SEQIDNo. 2 所示。
[0009] 第三方面，本发明提供前述基因序列的克隆方法，具体为：以海岛棉基因组DNA为 模板，利用引物采用染色体步移法克隆得到所述基因序列；
[0010] 所述引物的核苷酸序列如下：
[0011]GSP1:5 ' -AACTTGGCGGCTTGCTGGGTGACTTGG-3'
[0012] GSP2:5' -GCGTAAGTTGGCGGCTTGCTTGGTGAC-3，。
[0013] 第四方面，本发明提供含有前述启动子或前述基因序列的表达载体。
[0014] 作为优选，所述表达载体为真核表达载体，进一步优选为pBI121载体。例如，所述 真核表达载体可以为将前述启动子或前述基因序列克隆进PBI121载体获得。
[0015] 第五方面，本发明提供含有前述表达载体的宿主。
[0016] 可选的，所述宿主可以为大肠杆菌、模式生物（如拟南芥）、棉花等。
[0017] 例如，所述棉花可以为海岛棉Pima90_53或中棉所8号。
[0018] 第六方面，本发明提供前述启动子或前述基因序列在调控植物对黄萎病菌的抗病 性方面的应用。作为优选，所述植物为棉花。更为优选，所述棉花为海岛棉。
[0019] 本发明的有益效果在于：
[0020] 本发明提供了海岛棉GbHyPRP1基因启动子及GbHyPRP1基因0RF5 '端DNA片段 pGbHyPRPl。并通过实验验证了所述启动子中与激素和效应子调控相关的元件，并发现其具 有启动GUS基因表达的能力，在根尖优势启动。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明PCR扩增GbHyPRPl0RF5'端DNA片段的电泳图；其中：M:DNA分子 量标准DL5000 ;1:GbHyPRPl0RF5' 端DNA片段。
[0022] 图2为本发明所述GbHyPRPl0RF5'端DNA片段序列。
[0023] 图3为本发明所述pGbHyPRPl中与激素和效应子调控相关元件。
[0024] 图4为本发明所述pGbHyPRPl在转基因拟南芥中的表达模式。
【具体实施方式】
[0025] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 实施例1
[0029] 1.供试材料
[0030] 1. 1植物材料
[0031] 供试棉种为抗黄萎病品种海岛棉Pima90_53。用于转基因拟南芥为Columbia生态 型。
[0032] 1. 2菌株与载体
[0033] 大肠杆菌TOP10感受态细胞（CB104)购自天根生化科技（北京）有限公司。T克 隆载体pEASY-TlSimple购自北京全式金生物技术有限公司。农杆菌GV3101和植物超表 达载体PBI121由本研究室保存。
[0034] 1. 3主要试剂
[0035]GenomeWalkingKit购自宝生物工程（大连）有限公司；5-溴-4-氯-3-口引 噪-β-D-葡萄糖苷酸（X-Gluc)购自西格玛奥德里奇中国公司；Plant GenomicDNAKit购自北京全式金生物技术有限公司。E.Z.N.A. ?GelExtractionKit购 自美国OmegaBio-tek公司。2XEsTaqMasterMix(含染料）购自康为世纪生物科技有限 公司。DNAMarkerDL2000和DL5000购自宝生物工程（大连）有限公司。其他试剂及化学 药品均为国产分析纯。
[0036]引物委托生工生物工程上海（股份）有限公司合成。
[0037] 1. 4主要仪器
[0038]HirayamaHVE-50 高压灭菌锅；Eppendorf移液器；ABI2720PCR仪；北京六一 DYCP-31BN琼脂糖水平电泳槽；北京六一DYY-iro(P)型电脑三恒多用电泳仪；Thermo ScientificNanoDrop2000超微量分光光度计。
[0039]2.试验方法
[0040] 2.1基因组DNA提取
[0041] 生长约2周的棉苗根组织用于基因组DNA提取，具体操作按Plant GenomicDNAKit说明书进行。
[0042] 2· 2GbHyPRPl0RF5' 端DNA片段克隆
[0043] 2. 2. 1以提取的基因组DNA为模板，采用染色体步移法克隆GbHyPRPl 0RF 5'端 DNA片段，具体操作按照Genome Walking Kit说明书进行。基因特异引物为：
[0044]GSP1 :5，-AACTTGGCGGCTTGCTGGGTGACTTGG-3'
[0045]GSP2:5' -GCGTAAGTTGGCGGCTTGCTTGGTGAC-3，。
[0046] 2. 2. 2对PCR产物进行1%琼脂糖电泳检测（110V，20min)，并利用E.Z.N.A. ?Gel ExtractionKit对目的条带回收。
[0047] 2. 2. 3将胶回收的目的片段与pEASY-TlSimple载体进行连接，反应体系如下：
[0048]