一种提高肝胰腺糖原累积的Esflol基因序列及其应用
【专利说明】
[0001] 本研究受到国家自然科学基金青年基金（31302168);天津市应用基础与前沿技术 研究计划（一般项目）（14JCYBJC30700);天津师范大学博士基金（52XB1303)的支持。
技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，具体是一种提高肝胰腺糖原累积的Esflol基因序列 及其应用。
【背景技术】
[0003] 甲壳动物高血糖激素（CHH)，是神经多肽激素家族的成员之一。该蛋白仅存在于 节肢动物中，在血淋巴葡萄糖水平调节、蜕皮以及应激过程中起着关键作用。虽然细胞膜上 的鸟苷酸环化酶（GC)已被公认为Y器官的CHH受体，但在肝胰脏中的受体仍然没有确定。 在本研究中，我们通过对河蟹转录组分析，筛选克隆到了一个在去眼柄后表达量提高了 2. 8 倍的基因一中华绒螯蟹flotilin类似蛋白（Esflol)作为目标分子去研究。在对河蟹的 Esflol基因进行RNA干扰后，机体的葡萄糖水平下降，促使糖原累积到了肝脏。中华绒螯蟹 简称河蟹，每100克河蟹食用部分中含蛋白质14%，脂肪5. 9%，碳水化合物7%，此外，还含有 维生素A、核黄素、烟酸，其发热量超过一般鱼类的营养水平。其中富含的维生素A更是人体 不可或缺的一种微量元素，行使着促进儿童生长发育，预防夜盲症与保持上皮组织的健康 状态等重要生理作用。
[0004] 河蟹自身所拥有的这些特点使其具有可观的市场经济价值，也推动了其养殖业的 发展。目前，河蟹的养殖已经打破了传统的地域界限，河蟹的养殖已出现在江苏、安徽、河 北、广东、福建等多个省份；养殖方式也由传统的资源放流型养殖发展为当下的集约化高密 度养殖。近年，河蟹的出口量也在不断攀升，所以为了满足不断攀升的市场需求，发展河蟹 的养殖业成为关键所在，而如何缩短中华绒螯蟹的生长期，加快其生长发育，提高产品的质 量与产量成为了这一行业发展中的重中之重。
[0005] 肝胰腺是河蟹重要的组织器官，肩负着许多生理功能，其中包括合成并分泌消化 酶、吸收营养物质、存储无机物，代谢糖类物质，除此之外肝胰腺还参与排泄与蜕皮等生理 活动。河蟹的肝胰腺主要由多种细胞构成，根据细胞形态和功能可以分为四种，即胚细胞（E 细胞)、分泌细胞（B细胞)、吸收细胞（F细胞)、储存细胞（R细胞)。其中R细胞主要形式储 存功能，R细胞的胞质中具有圆形的小液泡，近圆形的细胞核靠近细胞基部，部分细胞具有 大小不一的双核，两核或紧贴或分开。R细胞中具有大量的粗面内质网和噬碱性强的脂滴， 胞质中游离核糖体的数量同样非常之多，除此之外还分布有少量的线粒体和一些小液泡。R 细胞发达的脂肪体使其具有储藏功能，储存着河蟹生活必需的能量来源。
[0006] 碳水化合物是细胞生命活动最直接的能源。在河蟹生长的初期阶段，饲料中的糖 分含量是决定成活率的第一限制因素。一旦河蟹在发育阶段缺乏糖类营养物质，就会使体 内的脂类作为能量物质被大量消耗，这样就会无法满足生殖腺发育对脂类物质的需求，影 响河蟹个体的发育。作为食物来说，河蟹有三大可食部位：肌肉、肝胰腺和性腺，其中肝胰腺 因具有独特的风味和较高的营养价值是最受食客青睐的重要部分之一。醛类化合物是影响 熟蟹肝胰腺风味的重要挥发性物质，由脂质受热降解形成。河蟹中的蛋白质与脂质类物质 具有很高的营养价值。所以肝细胞是否可以大量储存糖原物质，并高效转化为河蟹个体可 以直接利用的能源对于缩短河蟹成熟期、使蛋白质与脂质富集有着重要意义。
[0007] 甲壳动物高血糖素（CHH)属于CHH神经肽家族。这个家族包含了一类结构相关的 多肽，包括蜕皮抑制激素（MIH)，卵黄/精巢抑制激素（VIH/GIH)，大腭器抑制激素（Μ0ΙΗ)以 及离子转运多肽（ITP)。所有这些成员都只在节肢动物中发现。
[0008] 学界广泛认为，CHH是能够调控几种生理活性的多效分子，如血糖水平，脂类代谢， 蜕皮与应激反应。第一次对CHH的描述是关于其对糖代谢的调控的。肝脏和肌肉是CHH的 主要靶标器官，肝脏在蜕皮过程中的所起到的作用是储存能量，肌肉亦是另一个糖原的储 存场所。学者们认为，CHH在对下游分子的调节机理上在肝脏和肌肉这两种器官中是明显 不同的。肌肉的糖原只供给其自身，相比之下肝脏所合成与储存的糖原是供给全身的。
[0009] 在外界环境的胁迫下，机体中糖原的变化和总碳水化合物的变化总是伴随着CHH 的分泌量的变化。当剪去斑节对虾和罗氏沼虾的眼柄后，糖原磷酸化酶明显下降而糖原合 成酶的明显上升，这预示着去除眼柄能够促进糖原的积累。另外，肝胰腺在含CHH溶液中的 浸泡能够使得葡萄糖转化为糖原的比例降低。综合这些得到的证据表明CHH确实是参与肝 脏的糖原代谢的，但CHH的受体以及信号传导通路还是不明确。在甲壳动物中，已经明确的 证实了当减去眼柄之后，肝脏的细胞内cGMP水平会显著下降，而不是cAMP。也即表明，在甲 壳动物中蛋白激酶G替代了蛋白激酶A参与到了CHH介导酶激活系统。但是细胞膜表面直 接和CHH作用的分子依然悬而未决。
[0010] flotilins被认为是定位在细胞膜表面脂後（lipidraft)上的连接性蛋白。除此 之外，它们能分布在细胞内体，吞体，高尔基体甚至细胞核，直到现在，关于flotilins是 否只在质膜上存在还没有定论。
[0011] 在flotilin家族中存在两种同源异构体，flotilinl和flotilin2。一般认为， 这两类蛋白会相互结合形成异源多聚体，并参与到一些细胞活动中，如轴突再生，膜蛋白更 新，以及内吞作用等等。虽然flotilin在种间进化上十分保守，但它的确切功能依然存在 较大的争议并需要进一步的证据来证明许多的推断。最早，在金鱼的视网膜细胞轴突再生 的研究中发现了flotilin，当时被命名为再生reggies。敲除flotilins可显著减弱机体对 胆固醇的吸收，这意味着它在NPC1L1介导的胆固醇吸收机制中起着关键的作用。在T细胞 中，flotilins被定位在细胞的一端，形成一个flotilin帽子结构，这个结构能够激活PrPe 导致主要的T细胞受体复合体CD3的回收，而连接这一受体和一类信号分子如Vav的通路 也被人们发现。也就是说，flotilin形成的亚结构能作为T细胞的信号平台。
[0012] 据推测，在细胞某些特定位置的Flotilins能够参与细胞膜以及膜表面蛋白的更 新。在脂肪细胞，Flotilins能够从细胞深层将GLUT4回收到细胞表面。一些数据还支持 说Reggie/flotilin蛋白能在细胞相互接触的区域参与信号过程。
[0013] 作为理解甲壳动物中Flotilin类似蛋白功能的第一步，我们找到了一个了河蟹 E.sinesisflotilin类似基因，命名为Esflol。在本研究中，我们分析了序列，表达特征， 以及在肝脏器官的组织定位，并进行了RNA干涉实验。
【发明内容】
[0014] 本发明公开了一种河蟹E. sinesis flotilin类似基因，命名为Esflol基因序列， 其特征在于该基因序列中开放阅读框（0RF)全长1281bp，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸 序列。
[0015] 本发明所述Esflol基因序列，其所对应的氨基酸序列如SEQ ID N0. 2所示；该序 列编码426个氨基酸，序列编码的蛋白理论等电点为9. 150,分子量为47. 18kD。
[0016] SEQ ID Ν0· 1所示的Esflol核苷酸序列： ATGATTCCCATTTTCATCACGTGTCCGCCCAATGAAGTCCTGGTGGTGTCTGGCCTCGGGTTCACGCAGCC AGCCATGATCACTGGAGGCCGCGTGCTCGTCGTGCCCGGCCTGATGAGATGGAGCAGACTGTCCCTGAACGTTCGC ACCATCACAGTCCACTCACCTGATGTGTACACGGCCCGAGGTGTTGCCATCAAGGTTACAGGAGTAGCTCAGGTCAA AATCAACACCCAGCATCCCAAGGTCCTGGCGATGGCTTG