诱导并过夜培养，获得诱导培养的大肠杆菌K-12MG1655,将诱导培 养的大肠杆菌K-12MG1655在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素和浓度为lmg/mL的阿拉伯 糖的LB固体培养基中划线培养，获得poxb基因（Genbank登录号ALI50137. 1)被敲除的大 肠杆菌K-12MG1655,记为实验组；对照组为将大肠杆菌K-12MG1655阳性转化子直接转入 含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基中，获得大肠杆菌K-12MG1655菌液，将 大肠杆菌K-12MG1655菌液于含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基中划线培 养，获得poxb基因未被敲除的大肠杆菌K-12MG1655。
[0075] 分别挑选11株实验组poxb基因被敲除的大肠杆菌K-12MG1655的单菌落和3株 对照组poxb基因未被敲除的大肠杆菌K-12MG1655的单菌落，分别进行菌落PCR验证，验证 引物为pkd_poxb-F:CGCCTTATGCCCGATGATATTC和pkd_poxb-R:CCAGCACGCTGTTGTTAAAGAC， 对于获得的PCR扩增引物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图4所示，实验组的11株菌株 均完成poxb基因敲除，PCR片段大小为1008bp;对照组的3株菌株poxb基因均未被敲除， PCR片段大小为1521bp。
[0076] 编辑效率=编辑成功的菌落数/实验组总菌落数X 100%。
[0077] 采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对大肠杆菌K-12 MG1655进行基因编辑 (poxb基因敲除）的编辑效率为100%。
[0078] 二、利用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对大肠杆菌K-12 MG1655进行基因 敲入实验
[0079] 含有限制性核酸内切酶Bsal位点的模块A、含有限制性核酸内切酶Bsal位点的模 块B和含有互补粘性末端的模块C的制备方法同步骤一。
[0080] 对于基因敲入，同源重组元件中的左右同源臂，以大肠杆菌K-12MG1655的基因组 为模板，通过PCR反应的方式获得，其中左同源臂（即为上游同源臂）两端的引物分别添加 (5' 一 3'）CCAGGTCTCAGTGC和CCAGGTCTCACGCT序列，右同源臂（即为下游同源臂）两端 分别添加（5' 一 3'）CCAGGTCTCATCCG和CCAGGTCTCAGAGC序列；敲入基因以rfp基因（核 苷酸序列为SEQIDNo. 3)为模板，通过PCR方式获得，其中引物两端分别添加（5' 一3'） CCAGGTCTCAAGCG和CCAGGTCTCACGGA序列；含有限制性核酸内切酶Bsal位点的模块D包括 左同源臂、敲入基因和右同源臂。
[0081] 含有限制性核酸内切酶Bsal位点的模块A、含有限制性核酸内切酶Bsal位点 的模块B、含有互补粘性末端的模块C和含有限制性核酸内切酶Bsal位点的模块D通过 如下体系连接成编辑质粒：20 μ L反应体系中含有限制性核酸内切酶Bsal位点的模块A 2. 7E-8mol(约为50ng)含有限制性核酸内切酶Bsal位点的模块B 2. 7E-8mol，含有互补粘 性末端的模块C 2. 7E-7mol ;含有限制性核酸内切酶Bsal位点的模块D的左同源臂和右同 源臂以等摩尔量加入，均为2.7E-8mol;BsaI酶lyL，T4 DNA Ligase lyL，10XT4 buffer 2 μ L，lOxBSA蛋白溶液2 μ L，用水补齐至20 μ L，并通过如下反应条件进行链接：37°C反应 3min ;16°C反应4min，共进行25个循环；50°C反应5min，然后80反应5min。反应结束后， 获得大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体溶液。取5 μ L大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑 载体溶液电转入大肠杆菌K-12 MG1655感受态细胞中，并在含有浓度为50 μ g/mL的卡那霉 素的5mL LB液体培养基中筛选培养，获得大肠杆菌K-12 MG1655阳性转化子，将大肠杆菌 K-12 MG1655阳性转化子转入含有浓度为50 μ g/mL的卡那霉素和浓度为lmg/mL的阿拉伯 糖的LB液体培养基中诱导过夜培养，获得诱导培养的大肠杆菌K-12 MG1655,将诱导培养 的大肠杆菌K-12 MG1655在含有浓度为50 μ g/mL的卡那霉素和浓度为lmg/mL的阿拉伯糖 的LB固体培养基中划线培养，获得含有敲入基因的大肠杆菌K-12 MG1655,记为实验组；对 照组为将大肠杆菌K-12 MG1655阳性转化子直接转入含有浓度为50 μ g/mL的卡那霉素的 LB液体培养基中，获得大肠杆菌K-12 MG1655菌液，将大肠杆菌K-12 MG1655菌液于含有 浓度为50 μ g/mL的卡那霉素的LB固体培养基中划线培养，获得未被编辑的大肠杆菌K-12 MG1655。
[0082] 分别挑选8株实验组含有敲入基因的的大肠杆菌K-12MG1655的单菌落和2株对 照组未被编辑的大肠杆菌K-12MG1655的单菌落，分别进行菌落PCR验证，验证引物为pkd_ poxb_F:CGCCTTATGCCCGATGATATTC和pkd_poxb_R:CCAGCACGCTGTTGTTAAAGAC，对于获得的 PCR扩增引物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图5所示，实验组的8株菌株均含有敲入基 因，PCR片段大小为1823bp;对照组的2株菌株均为未被编辑的大肠杆菌K-12MG1655,PCR 片段大小为1521bp。
[0083] 编辑效率=编辑成功的菌落数/实验组总菌落数X 100%。
[0084] 采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对大肠杆菌K-12MG1655进行基因编辑 (rfp基因敲入）的编辑效率为100%。
[0085] 实施例二、利用谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体对谷氨酸棒状杆菌进 行基因编辑
[0086] 谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体由乳糖操纵子、与乳糖操纵子连接的 Cas9蛋白基因、与Cas9蛋白基因连接的终止Cas9蛋白基因转录的终止子、与终止Cas9蛋 白基因转录的终止子连接的启动gRNA的编码DNA转录的启动子、与启动gRNA的编码DNA 转录的启动子连接的gRNA的编码DNA、与gRNA的编码DNA连接的终止gRNA的编码DNA转 录的终止子、与终止gRNA的编码DNA转录的终止子连接的per基因，与per基因连接的复 制起始位点（repAlOl蛋白基因）、与复制起始位点连接的卡那霉素抗性基因、与卡那霉素 抗性基因连接的同源重组元件组成。
[0087] SEQIDNo. 2所示的谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体（又为载体 pj5 00131)中（图6)，SEQIDNo. 2的第11351-12735位的核苷酸序列为乳糖操纵子， SEQIDNo. 2的第11351-12433位的核苷酸序列为乳糖操纵子中的laclq基因，SEQID No. 2的第12490-12735位的核苷酸序列为乳糖操纵子中的Ptrc启动子；SEQIDNo. 2的 第12755-4069位的核苷酸序列为Cas9蛋白基因；SEQIDNo. 2的第4070-4124位的核苷 酸序列为终止Cas9蛋白基因转录的终止子；SEQIDNo. 2的第4125-4168位的核苷酸序列 为启动gRNA的编码DNA转录的启动子；SEQIDNo. 2的第4173-4192位所示的核苷酸序 列为受体菌的目的DNA[含有5' _(N)x-NGG-3'结构中的（N)x，X为20];SEQIDNo. 2的第 4193-4270位的核苷酸序列为gRNA的编码DNA;SEQIDNo. 2的第4271-4701位的核苷酸序 列为终止gRNA的编码DNA转录的终止子；SEQIDNo. 2的第5422-5367位的核苷酸序列为 per基因；SEQIDNo. 2的第6280-7743位的核苷酸序列为r印A101蛋白基因；SEQIDNo. 2 的第8273-9067位的核苷酸序列为卡那霉素抗性基因；SEQIDNo. 2的第9168-10173所示 的核苷酸序列为同源重组元件的上游同源臂和下游同源臂。
[0088] 谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体采用模块的方式构建，各个模块的接 头以Goldengate的思路进行设计：在各个模块的两端加上限制性核酸内切酶Bsal的位点 或互补的粘性末端，酶切位点通过PCR引物的方式添加。
[0089] 谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体包括模块E、模块F、模块G和模块H， 模块E含有乳糖操纵子中的lacIq基因和Ptrc启动子、Cas9蛋白基因、终止Cas9蛋白基因 转录的终止子和启动gRNA的编码DNA转录的启动子（图7);模块F含有gRNA的骨架DNA、 终止gRNA的编码DNA转录的终止子、per基因、复制起始位点（r印A101蛋白基因）和筛选 标记基因（图8);模块G含有5' _(N)x-NGG-3'结构中的（N)x，X为20 ;模块Η含有同源重 组元件，同源重组元件含有与受体菌的基因组DNA靶位点附近发生同源重组的上游同源臂 和下游同源臂；gRNA的骨架DNA为将gRNA的编码DNA中的（Ν)χ去除得到的DNA。
[0090] 谷氨酸棒状杆菌CRISPR/Cas9基因编辑载体中，乳糖操纵子为SEQIDNo. 2 的第11351-12735位所示的核苷酸序列，乳糖操纵子中laclq基因为SEQIDNo. 2的 第11351-12433位所示的核苷酸序列，乳糖操纵子中Ptrc启动子为SEQIDNo. 2的第 12490-12735位所示的核苷酸序列；Cas9蛋白基因为SEQIDNo. 2的第12755-4069位所示 的核苷酸序列编码；终止Cas9蛋白基因转录的终止子为SEQIDNo. 2的第4070-4124位所 示的核苷酸序列；启动gRNA的编码DNA转录的启动子为SEQIDNo. 2的第4125-4168位 所示的核苷酸序列；受体菌的目的DNA[含有5' _(N)x-NGG-3'结构中的（N)x，X为20]为 SEQIDNo. 2的第4173-4192位所示的核苷酸序列；gRNA的骨架DNA为SEQIDNo. 2的第 4193-4270位所示的核苷酸序列；终止gRNA的编码DNA转录的终止子为SEQIDNo. 2的第 4271-4701位所示的核苷酸序列；per基因为SEQIDNo. 2的第5422-5367位所示的核苷酸 序列；复制起始位点（r印A101蛋白基因）为SEQIDNo. 1的第6280-7743位的核苷酸序列； 筛选标记基因为SEQIDNo. 2的第8273-9067位的核苷酸所示的卡那霉素抗性基因；同源 重组元件的上游同源臂和下游同源臂为SEQIDNo. 2的第9168-10173所示的核苷酸序列。 [0091] 模块E和模块F通过PCR反应获得限制性核酸内切酶Bsal位点，得到两端带有限 制性核酸内切酶Bsal位点的模块E和两端带有限制性核酸内切酶Bsal位点的模块F;模 块E的PCR反应所用的引物对为PartE-F(5 ' -CCAGGTCTCAGCTCAGATCCTTT