钌配合物作为靶向细胞核核酸载体的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及钌配合物的新应用，特别涉及钌配合物作为核酸载体的新应用。
【背景技术】
[0002] 基因治疗（genetherapy)技术对肿瘤等疾病的治疗日益受到研究者的重视和关 注。所谓基因治疗是指把某些功能性遗传物质，包括siRNA，mRNA、miRNA、DNA、核酸适配体 以及癌症基因的启动区序列转染（transfection)到细胞中，使其在细胞中表达，最终达到 治疗疾病的目的。基因治疗的关键是安全、高效的载体（vector)将治疗基因转染到细胞 中。通常可以米用病毒（viral)载体如RNA病毒或DNA病毒，或者非病毒（non-viral)载 体包括磷酸1丐沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等转染治疗基因（H.Yin,R.L.Kanasty, A.A.Eltoukhy,A.J.Vegas,J.R.Dorkin,D.G.Anderson,Non-viralvectorsfor gene-basedtherapy,NatureRev. , 15, 541-555, 2014;ViktoriyaSokolovaand MatthiasEpple,InorganicNanoparticlesasCarriersofNucleicAcidsinto Cells,Angew.Chem.Int.Ed. 2008, 47, 1382 - 1395;S.Huo,S.Jin,X.Ma,X. Xue,K.Yang,A.Kumar,P.C.Wang,J.Zhang,Z.Hu,X. -J.Liang,Ultrasmallgold nanoparticlesascarriersfornucleus-basedgenetherapyduetosize-dependent nuclearentry,ACSNANO, 8(6), 5852-5862, 2014)。但是这些方法由于各自的缺陷和 不足，在临床上的应用仍然受到较大限制。
[0003] 近年来，应用钌（II)配合物作为基因载体的研究引起研究者的广泛兴趣。 Kumbhar等报道了一种应用f了多吡啶配合物作为基因载体的应用（S.S.Bhat,A.S. Kumbhar,A.K.Kumbhar,A.Khan,P.Lonnecke,Rutheium(II)polypyridylcomplexes ascarriersforDNAdelivery,Chem.Comm.，2011，47，11068-1070);巢辉等人 报道了多吡啶钌（II)配合物作为基因载体的方法（B.Yu，Y.Chen，C.Ouyang，Η. Huang,L.JiandH.Chao;Aluminescenttetranuclearruthenium(II)complexas atrackingnon-viralgenevector,Chem.Commun·，2013，49，810-812).但是这些 报道中所使用的钌配合物分子分子量相对较大，合成工艺相对复杂，其作为基因载体的效 果十分有限，且上述报道钌配合物及其光学异构体均未报道作为靶向细胞核的基因载体的 应用。由于基因的复制转录的主要场所为细胞核，因此将核酸靶向性的转运到细胞核可以 提高基因的自我复制和转录应用效率，获得更好的疗效。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供钌配合物作为核酸载体的应用。
[0005] 实验数据表明，具有下述通式的钌（II)配合物，可以与核酸序列有效地结合在一 起，并有效改变长序列(如50bp以上)核酸的形态，使得其可以有效地跨膜运输至活细胞内， 并很好地定位于细胞核中，大大提高了核酸的运载效率。利用这一特性，可以方便地转运核 酸序列至细胞内，进行基因治疗，或进行荧光示踪等。
[0006] 钌（II)配合物具有如下结构通式：
R独立选自取代烷基、取代苯基、取代吡啶基、取代呋喃基、取代噻唑和取代吡咯的取代 基任选自羟基、硝基、卤素、氨基、羧基、氰基、巯基、碳原子数为3~8的环烷基、S03H、碳原 子数为1~6的烷基、碳原子数为2~6的链烯基、碳原子为2~6的链炔基、羟基（C「C6)烷 基、氨基（(：「(：6)烷基、〇)21?'、〇)謝'1?'、〇)1?'、30 21?'1?'、（(：「(：6)烷氧基、（(：「(：6)烷硫基、4=謝'、 NR'R'或三氟（CfC6)烷基；其中，所述R'选自H、碳原子数为1~6的烷基或苯基； 札独立选自氢，羟基，三甲基硅基，碳原子数为1~6的烷基或碳原子为1~6的取代烷 基，苯基或取代苯基，吡啶基或取代吡啶基，呋喃基或取代呋喃基，吡咯基或取代吡咯基，噻 唑或取代噻唑基；式中&取代的乙炔基位置可以位于苯环的邻位、间位或者对位；取代乙 炔基的数量为1个，2个或者是多个；R2独立的选自甲基、甲氧基、硝基、卤素；Y为使钌（II) 配合物整体呈电中性的离子或者酸根离子，η为使钌（II)配合物整体呈电中性的离子或者 酸根离子的数目； 核酸序列的长度至少为4bp。特别的，核酸的长度不超过3000bp。
[0007] 作为上述应用的进一步改进，钌配合物为其单一手性异构体。
[0008] 作为上述应用的进一步改进，核酸的长度不超过3000bp。核酸选自cmyc启动 区DNA,C-kit启动区DNA,bcl-2 启动区DNA,miR-21，AS1411 的DNA、SiRNA、microRNA、 核酸适配体以及mRNA。
[0009] 作为上述应用的进一步改进，核酸上标记有荧光基团。
[0010] 钌配合物-核酸复合物作为荧光探针的应用，其中钌配合物如上所述。
[0011] 钌配合物-核酸复合物的制备方法，包括如下步骤：将钌配合物与核酸溶液混合 均匀，加热至70~100°C并维持30S~30min;冷却后去除游离的钌配合物，得到钌配合 物-核酸复合物；其中，钌配合物的结构式如权利要求1~3任意一项所述，核酸的长度不 低于4bp。
[0012] 作为上述方法的进一步改进，使用微波进行加热。
[0013] 作为上述方法的进一步改进，核酸上标记有荧光基团。
[0014] 本发明的有益效果是： 本发明钌配合物-核酸复合物的制备方法，能够高效率地制备得到稳定的钌配合 物-核酸复合物，获得更好的效果。
【附图说明】
[0015] 图1~41分别是实施例1~41所使用的钌配合物的结构式(如有)及其与DNA复 合得到的复合物的??Μ图； 图42荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物（Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌HepG2细胞中的分布与定位； 图43荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物（Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在宫颈癌Hela细胞中的分布与定位； 图44荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物（Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在乳腺癌MCF-7细胞中的分布与定位； 图45激光共聚焦显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物 (/l-Ru(bpy)2pBEPIP](C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌HepG2细胞中的分布与定 位； 图46激光共聚焦显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物 (/l-Ru(bpy)2pBEPIP](C104)2:FAM-c-mycpu22DNA=1:1)在肝癌MCF-7细胞中的分布与定 位； 图47荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物(』-Ru(bpy)2pBEPIP](C104)2: FAM-c-myc pu22 DNA=1:1)在肝癌HepG2细胞中的分布与定 位； 图48荧光显微镜下观察钌配合物-核酸（FAM荧光标记）复合物（/1-Ru(bpy) 2pEPIP] (C104)2:FAM-AS1411DNA=1:1)在肝癌!fepG2细胞中的分布与定位。
【具体实施方式】
[0016] 本发明所使用的钌配合物，可参照本发明人之前的专利申请（CN103709202A、 CN103788134A)或其他公知的方法合成得到。
[0017] 下面结合实施例，进一步说明本发明的技术方案。
[0018] 以下实施例中使用的核酸序列如下： c-myc Pu22:5, - TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA-3'（SEQIDN0:1) Bcl-2 Pu27 :5' - CGGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGGAGC-3' （SEQID N0:2) c-Kit 1：5, -GGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3' (SEQID NO：3) K-ras：5,-GCGGTGTGGGAAGAGGGAAGAGGGGGAGGCAG-3, (SEQ ID NO：4) 端粒DNA序列：5' -TTAGGG-3' AS1411 序列：5,-GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG-3'(SEQIDNO:5)miR-21RNA序列：5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'（SEQIDNO:6) PAR-1siRNA: 5' -AGAUUA⑶CUCCAUCAUA-3'（SEQIDNO:7)。
[0019]实施例 1: [Ru(bpy)pBEPIP] (C104)2-c-myc启动区DNA复合物的制备 实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2 (图 1A)与 1mMc-mycPu22 溶液按 1:1 均匀混合，加热至90°C维持0. 5~lOmin，然后自然冷却至室温，4°C静置24小时。将反应 混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌（II)配合物，得多吡啶钌（II) 配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了c-mycPu22序列发生自组装形成了纳 米管结构（图1B)。
[0020]实施例 2:[Ru(bpy) 2pBEPIP] (C104) 2-端粒DNA复合物的制备 实验方法：1mM[Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2与 1mM端粒DNA(5' -TTAGGG-3'）溶液按 1:1均匀混合，溶液按1:1均匀混合，加热至90°C，维持0. 5~lOmin，然后自然冷却至室温， 4°C静置24小时。将反应混合物用蒸馏水进行透析，除去未负载到核酸里的多吡啶钌（II) 配合物，得多吡啶钌（II)配合物-核酸复合物，TEM检测发现钌配合物促进了端粒DNA序 列发生自组装形成了类似纳米管结构（图2)。
[0021] 实施例3: [Ru(bpy)2pBEPIP] (C104)2与bcl-2启动区DNA复合物的制备 实验方法：lmM[Ru(bpy)2pBEPIP](C10 4)2与lmMBcl-2pu27溶液按l:l均匀混合， 加热至