一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突 变的方法。本发明可用于高效地制备非人基因突变动物。
【背景技术】
[0002] 基因突变能改变特定基因的DNA核苷酸序列，具体种类包括碱基置换突变，移码 突变，缺失突变和插入突变。基因突变造成特定基因产物的表达量或者功能发生变化，从而 导致细胞水平上的生物学过程发生改变，以及动物个体水平上的表型发生异常（Griffiths 等编著的《IntroductiontoGeneticAnalysis》第十版）。
[0003] 携带基因突变的实验动物模型在生物学研究和新药开发中是非常重要的资源。在 生物学研究中，携带随机基因突变的动物可被用于发现具有特定功能的新基因。针对携带 基因突变的动物进行的表型分析有助于发现特定基因的新功能。在新药开发领域，携带致 病基因突变的动物可用于模拟人类疾病，以及研究疾病发生机理。此外，基因突变疾病动物 模型还可以在临床前试验中用于筛选能缓解疾病表型的新药，以及确定新药的安全性和有 效性。当特定基因突变在动物模型中引起抗疾病表型时，相应基因可被直接候选为新型的 药物靶点。
[0004] 现有制备基因突变动物的方法主要涉及离体胚胎干细胞基因操作（Bradley等， 1984,Nature309 :255-256;Thomas和Capecchi，1987,Cell51 :503-512)和离体受精 卵原核显微注射（Behringer等编著的《ManipulatingtheMouseEmbryo:ALaboratory Manual》第四版）。这些制备方法花费大，耗时长，技术要求高，而且在制备基因突变动物过 程中还需要将离体细胞植入假孕雌性动物体内。
[0005] 雄性动物睾丸内的精原干细胞可以分化形成成熟的精子，是另一种可被用于制备 转基因动物的细胞源。将整合型慢病毒（Lentivirus)注射入正处于发育阶段的睾丸内， 可以直接感染体内精原干细胞（Sehgal等，2011，PL〇SOne6:e21975)。该方法可以简单 易行地对非人动物进行在体基因操作。但在诱导基因突变方面，由于整合型慢病毒偏好 插入于基因组中具有转录活性的区域，故无法做到完全地介导覆盖全基因组地随机插入 (Schroder等，2002,Cell110 :521-529;Mitchell等，2004PLoSbiology2 ;e234)〇
【发明内容】
[0006] 为了能高效地制备携带随机插入突变的基因突变动物，本发明提供了一种携带 piggyBac转座子系统的非整合型慢病毒复合载体及其制备方法，以及应用该复合载体在体 内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法。
[0007] 转座子插入突变技术是另一种在实验动物中引入插入突变的方法。piggyBac转 座子（PB)系统是现有在哺乳动物中诱导插入突变效率最高的转座子系统（Ding等，2005， Cell122 :473-483;Wang等，2008,Proc.Natl.Acad.Sci.USA105 :9290-9295)。piggyBac 转座子早先于粉斑夜蛾（Trichoplusiani)的基因组中被发现，大小为2472bp，两端包含 反向末端重复序列（ITR)，中间包含编码594个氨基酸的转座酶。piggyBac转座子类属 于DNA转座子，通过剪切和粘贴机制可以由位于外源DNA或内源基因组的起始位点切离， 并插入基因组中的另一位点。piggyBac转座子插入革EU立点的序列为四核苷酸的TTAA。 piggyBac转座子在切离TTAA时一般不会改变原位点及原位点的附近序列，即所谓无痕转 座。piggyBac转座子在插入基因组时，不存在位点偏好性，随机整合入基因组，因此是介导 覆盖全基因组地随机插入突变优选的遗传工具（Cary等，1989,Virology172 :156-169 ; Fraser等，1995，Virology211 :397-407;Fraser等，1996,InsectMolecularBiology5: 141-151)。但是作为一种非病毒载体，生物技术领域至今仍缺乏一种有效利用piggyBac转 座子系统在体递送制备基因突变动物的方法。
[0008] 本发明在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变时利用了一种携带 piggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体，该复合载体中包含的元件从5'端到3'端分 别是： 自身失活型慢病毒5'长末端重复序列（5'LTR)，病毒包装所必须的中央聚嘌呤区cPPT顺式元件序列，piggyBac转座子左臂（PBL)，强效启动子，报告基因，聚腺苷酸（polyA)转录 终止信号，piggyBac转座子右臂（PBR)，土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件WPRE，自身失活型 慢病毒3'长末端重复序列（3'LTR)。
[0009] 在一优选例中，所述的强效启动子为鸡β-肌动蛋白复合启动子CAG。
[0010] 在另一优选例中，所述的报告基因为EGFP绿色荧光蛋白。
[0011] 在另一优选例中，所述的聚腺苷酸转录终止信号为兔β-球蛋白polyA。
[0012] 本发明在制备基因突变动物时所采用的技术方案是： 1) 将piggyBac转座子-慢病毒复合载体质粒，Δ8. 9-D64N/D116N非整合型包装结构 质粒和VSV-G包膜质粒通过脂质体转染同时导入293T细胞中，并通过上清高速离心浓缩获 得病毒； 2) 将携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒和携带piggyBac转座酶的非整合型慢病 毒同时直接注射入处于发育期的雄性非人动物睾丸内，感染体内精原干细胞； 3) 注射后的雄性动物在成年后与野生型雌性动物交配获得基因组中携带一个或多个 转座子随机插入突变的非人基因突变动物。
[0013] 本发明的有益效果是，提供了一种简单易行地对非人动物进行在体基因操作的方 法。该方法可以高效地制备携带随机插入突变的基因突变动物。通过本发明制备的基因突 变动物可用于动物表型分析，基因功能研究，人类遗传疾病模拟，新药筛选和新药靶发现。
【附图说明】
[0014] 下面结合附图对本发明进一步说明。
[0015] 图1是本发明piggyBac转座子-非整合型慢病毒复合载体及其在精原干细胞基 因组中引入随机插入突变的设计图。携带PiggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体 LV-PB[GFP]从5'端到3'端包含：5'LTR:自身失活型慢病毒5'长末端重复序列；cPPT:中 央聚嘌呤区顺式元件；PBL:piggyBac转座子左臂；CAG;鸡β-肌动蛋白复合启动子；EGFP: 绿荧光蛋白；ΡΑ:兔β-球蛋白polyA;PBR:piggyBac转座子右臂；WPRE:土拨鼠乙肝病毒 转录后调控元件；3'LTR:自身失活型慢病毒3'长末端重复序列。携带piggyBac转座酶的 非整合型慢病毒复合载体LV-PBase从5'端到3'端包含：5'LTR，cPPT，CAG，piggyBac转 座酶（PBase)，PA，WPRE和3'LTR。当LV-PB[GFP]和LV-PBase病毒颗粒同时感染精原干细 胞，病毒基因组进入细胞核。其中，PBase被转录并在细胞质中被表达。PBase转座酶入核 后介导piggyBac转座子转座，使其能随机插入精原干细胞基因组内。
[0016] 图2是本发明piggyBac转座子一慢病毒复合载体病毒制备方法的一种技术方案。 将携带piggyBac转座子的非整合型慢病毒复合载体LV-PB[GFP]质粒（或携带piggyBac 转座酶的非整合型慢病毒复合载体LV-PBase质粒），△ 8. 9-D64N/D116N非整合型包装结构 质粒和VSV-G包膜质粒通过脂质体转染同时导入293T细胞中，并通过上清高速离心浓缩获 得LV-PB[GFP]病毒（或LV-PBase病毒）。
[0017] 图3是本发明应用于制备基因突变动物的一种技术方案。将携带piggyBac转座子 的非整合型慢病毒LV_PB[GFP]和携带piggyBac转座酶的非整合型慢病毒LV-PBase同时 直接注射入处于发育期的受体公鼠睾丸内，感染体内精原干细胞。被注射后的公鼠在成年 后与野生型母鼠交配获得基因组中携带piggyBac转座子随机插入突变的基因突变小鼠。
[0018] 图4是本发明高效制备基因突变小鼠的一个实例。在蓝色光照射下，基因突变小 鼠体表产生绿色荧光。该荧光可在荧光解剖镜下观察到。图中所示的幼仔分别携带插入于 不同位点的piggyBac转座子，由于位置效应，个体呈不同亮度的绿色荧光。
【具体实施方式】
[0019] 本发明提供了一种携带piggyBac转座子系统的非整合型慢病毒复合载体及其制 备方法，以及应用该复合载体在体内精原干细胞基因组中引入随机插入突变的方法。本发 明可用于高效地制备非人基因突变动物。
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐明制备和应用本发明的关键步骤。
[0021] 1.非整合型慢病毒载体。
[0022] 慢病毒（Lentivirus)属于逆转录病毒，以人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiencyvirus，HIV)为代表。基于I型人类免疫缺陷型病毒（HIV-1)的慢病毒 载体目前已发展到第四代。第一代是复制缺陷型HIV-1慢病毒载体仅能感染CD4T细胞，并 存在产生野生型HIV的危险。第二代慢病毒载体采用了其它病毒的包膜蛋白代替HIV的包 膜蛋白，构建成假型慢病毒载体（pseudotypedlentivirusvector)。该载体的包膜蛋白为 水泡性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus，VSV)G蛋白，使病毒颗粒非特异性地结合 于靶细胞的膜磷脂，而不需要特异性膜受体。第三代慢病毒载体删除了与病毒包装和感染 无关的序列，这些序列通常与病毒复制和致病性有关。第四代慢病毒载体为自灭活性载体。 该类载体3'LTR中删除了所有参与病毒复制的非必需序列，使其经包装产生的子代重组病 毒完全失去了复制能力，因而更安全。慢病毒能感染各类哺乳动物细胞并整合到靶细胞基 因组中。慢病毒载体作