卷烟烟气中酚类化合物体外诱导上皮细胞中muc5ac表达的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及卷烟烟气毒理研究技术领域，具体涉及一种卷烟烟气中酚类化合物体 外诱导上皮细胞中MUC5AC表达的检测方法。
【背景技术】
[0002] 慢性阻塞性肺病（chronicobstructivepulmonarydisease，C0PD)是世界范围 内一种发病率高、致残致死率高、且严重影响患者生活质量的疾病，同时会加重患者的经济 负担。
[0003] 在各种致病因素中，吸烟是最重要的环境危险因素。据统计，由吸烟所致死亡的疾 病中，慢性肺部疾患占45 %，C0PD是其中的慢性肺病之一。国外有80 %~90 %的C0PD是 由吸烟引起的，我国约有72%的C0PD是由吸烟引起的。
[0004] 正常情况下，气管、支气管上皮细胞和黏膜下腺分泌的黏液能保护气道上皮免受 空气污染物和病原体的攻击，而在慢性气道炎症性疾病如慢性阻塞性肺病、哮喘等病理情 况下，常常伴有黏液过度分泌，过多分泌的黏液阻塞气道，使呼吸功能长期不能改善，且易 导致病原菌定植，引起反复感染，与病情严重程度密切相关。
[0005] 大量研究证实，气道黏液高分泌已成为coro急性加重期患者死亡率升高的独立 危险因素，在致死性哮喘患者气道中也发现有大量黏液阻塞，杯状细胞急性脱颗粒释放大 量黏液是造成哮喘急性恶化及死亡的重要原因。早有研究证实，吸烟患者的慢性支气管炎、 肺气肿、支气管哮喘、肺间质纤维化等一系列慢性炎性病变的发生率远远高于非吸烟者，且 病情更严重，不易缓解。
[0006] 长期大量吸烟的正常人中，虽然小气道形态学上并无异常，但上皮细胞中编码细 胞因子、固有免疫反应、凋亡、黏蛋白等的基因都存在调节上的异常，更易发生病变，导致 C0PD的发生发展。吸烟者气道的杯状细胞大量增生、肥大，其体积和数量多于吸烟者的数 倍，能储存高于正常2. 2倍乃至更多的黏液，在有小气道阻塞性病变的吸烟者中尤其显著， 故在急性发作期，更易产生黏液栓，使病情恶化。
[0007] 卷烟烟气是多种化合物组成的复杂混合物，截止1988年（据Roberts， 1988TobaccoR印orter报道）已经鉴定出烟气中的化学成分已达5068种，其中1172种是烟 草本身就有的，另外3896种是烟气中独有的。美国健康基金会副董事长D.霍夫曼博士列 出卷烟烟气中的44种主要有害成分，除焦油、烟碱和一氧化碳这些主要成分外，其他大致 可分为九类：①氨；②四种芳香胺；③苯并芘；④八种醛酮类化合物；⑤氢氰酸；⑥七种无 机元素；⑦七种酚类化合物；⑧四种烟草特有亚硝胺；⑨其他挥发性有机成分。
[0008] 酚类物质作为烟气中主要成份之一，对呼吸道具有强刺激作用以及致癌作用，目 前针对卷烟烟气中酸类物质体外诱导气道上皮Muc5ac表达，尚无公开发表的研究。
【发明内容】
[0009] 本发明提供了一种卷烟烟气中酚类化合物体外诱导上皮细胞中MUC5AC表达的检 测方法，操作简单，方便快速，灵敏度高，能够准确检测卷烟主流烟气中各种酚类物质对人 气道上皮细胞中MUC5AC表达的诱导作用。
[0010] -种卷烟烟气中酚类化合物体外诱导上皮细胞中MUC5AC表达的检测方法，包括：
[0011] 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有MUC5AC启动子的MUC5AC-promotor-pGL6质 粒；
[0012] 步骤2,将MUC5AC-promotor-pGL6质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，得到 MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE细胞；
[0013] 步骤3,在MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE细胞中加入卷烟烟气中的酚类化合物， 作用至少48h ;
[0014] 步骤4,对步骤3的作用产物进行荧光素酶活性检测，依据所得的荧光素酶活性， 得到上皮细胞中MUC5AC的诱导表达倍数。
[0015] 本发明选取人气道上皮细胞中MUC5AC启动子序列-1300-+48作为靶标序列，利用 PCR扩增该序列，并克隆到具有荧光素酶报告基因和G418筛选标记的PGL6质粒中，将测序 验证正确的质粒转染入人气道上皮细胞16HBE中，将转染后的细胞与卷烟提取物相作用， 获得上皮细胞中MUC5AC的表达程度。
[0016] 作为优选，MUC5AC-promotor_pGL6质粒的构建方法如下：
[0017] 步骤1-1、设计MUC5AC启动子-1300-+48的引物序列如下：
[0018]上游引物为：5' -AGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC-3'（序列如SEQ ID N0 :1所示的 DNA序列）；
[0019]下游引物为：5'-CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3'（序列如SEQ ID N0 :2所 不的DNA序列）；
[0020] 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增MUC5AC启动子序 列；
[0021] 步骤1-2、利用ΚρηI和XholI双酶切步骤1-1的PCR产物和质粒载体pGL6,用 T4DNA连接酶连接至少24h，得到MUC5AC-promotor-pGL6质粒。
[0022] 作为优选，步骤1-1中PCR反应的条件如下：
[0023]
[0024] 变性、退火、延伸循环28~30次。
[0025] 作为优选，PCR产物与pGL6载体的摩尔比为3:1。
[0026] 作为优选，利用Lipofectamine3000转染试剂将MUC5AC-promotor_pGL6质粒转染 入人气道上皮细胞16HBE中，然后采用G418筛选得到MUC5AC-promotor-pGL6-16HBE细胞。
[0027] 作为优选，步骤3中，酚类化合物的加入量为不对人气道上皮细胞16HBE产生细胞 毒性的最大量。
[0028] 本发明提供的检测方法，具有以下优点：
[0029] (1)由于卷烟烟气进入人体气道后主要作用细胞，本发明采用人气道上皮细胞作 为研究对象，更接近吸烟的实际状态。
[0030] (2)特异性的选取人气道上皮细胞中MUC5AC的启动子序列，使检测更加具有针对 性和特异性。
[0031] (3)建立MUC5AC-promotor-PGL6-16HBE稳转细胞，不用反复瞬时转染质粒，使筛 选更加快速和经济。
[0032] (4)采用荧光素酶报告基因作为最终检测指标，灵敏度高。
【附图说明】
[0033] 图la表示苯酚对16HBE的细胞毒作用；
[0034] 图lb表示间甲基苯酚对16HBE的细胞毒作用；
[0035] 图2a表示苯酚对16HBE中Muc5ac表达的诱导作用；
[0036] 图2b表示间甲基苯酚对16HBE中Muc5ac表达的诱导作用；
[0037] 图3为PGL6质粒图谱；
[0038] 图4表示卷烟提取物对人气道上皮细胞中Muc5ac的诱导作用。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1
[0040] 酚类物质是卷烟主流烟气中的主要物质之一，主要有苯酚、儿茶酚、间苯二酚、对 苯二酚、邻甲基苯酚、间甲基苯酚与对甲基苯酚。为检测这些酚类物质是否是吸烟导致肺部 炎症的主要化合物，对苯酚、间甲基苯酚是否会诱导人气道上皮细胞中MUC5AC的表达进行 检测，包括以下步骤：
[0041] 步骤1，以pGL6为质粒载体，构建含有MUC5AC启动子的MUC5AC-promotor-pGL6质 粒，构建方法如下：
[0042] 步骤1-1、设计MUC5AC启动子-1300-+48的引物序列如下：
[0043]上游引物为：5 ' -AGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC-3 '；
[0044]下游引物为：5 '-CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA-3'；
[0045] 以人气道上皮细胞16HBE的总基因组DNA为模板，利用PCR扩增MUC5AC启动子序 列。
[0046] PCR反应体系包括：
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[0048] PCR反应的条件如下：
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[0050] 将PCR产物利用1%琼脂糖凝胶，110V，20min电泳分离后，得到的扩增条带中的目 的条带约680bp切下，用GelExtractionKitDNA纯化试剂盒进行纯化。
[0051] 步骤1-2、采用ΚρηI和XholI双酶切纯化产物5h，同时采用ΚρηI和XholI双 酶切2μg质粒载体pGL65h，再次纯化回收后，用T4DNA连接酶在16°C下连接24h。
[0052] 连接反应体系如下：
[0053