一种基于bodipy的荧光氨基酸及其合成方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及医学生物工程领域，具体地指一种基于B0DIPY的巧光氨基酸及其合 成方法与应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质作为构成生命体系的Ξ大物质基础之一，几乎参与着生命活动的每一个环 节，在生命的诞生、成长和繁衍过程中起着决定性的作用。许多疾病的发生也与多肤、蛋白 质在体内发生变异有着密切的关系。因此选择与重大疾病密切相关的蛋白质、多肤W及氨 基酸残基作为祀标，发展具有高选择性，高灵敏度的检测方法，对生命奥秘的掲示，疾病的 早期诊断与药物的筛选有着重大的意义。
[0003]目前诊断多肤及蛋白质的检测方法主要有免疫标记法，同位素标记法和巧光检测 法等。免疫标记法很难实现对活体的检测，同位素标记法具有放射性危害，需要专口的人员 操作。相对而言，巧光检测法因其具有灵敏度高、选择性好，动态响应范围宽，能在活体内检 测等优点在蛋白质检测中得W广泛应用。巧光检测法根据祀向蛋白的结构和性质设计多肤 巧光探针，根据巧光光谱的变化来检测目标对象，它是痕量蛋白检测的重要方法。
[0004] 构建多肤巧光探针需要考虑两个方面问题：一，多肤的氨基酸系列和结构； 二，用于标记的巧光基团。已知的多肤及蛋白质的二级结构主要有β-turn,β-sheet 和α-helix。通过合成β-turn模拟物并将其引入到一个多肤序列中，从而诱导 β-sheet结构的形成，运类工作已多有报道[(a)Robinson,J.A.;Thedesi即，synthesis andconformationofsomenewβ-hairpinmimetics:novelreagentsfordrug andvaccinediscovery.Synlett, 1999, 4, 429-441.化）Souers,A.J. ；E1Iman,J. A.β-turnmimeticlibrarysynthesis:scaffoldsandapplications.Tetrahedr on, 2001,57, 7431-7448. ] 〇
[0005] 目前，用巧光基团进行标记主要采用两种方法：一，首先合成多肤，然后在此多肤 上通过化学方法引入巧光标记基团。此方法比较繁琐，需要考虑到巧光基团标记的位点和 可行性。二，首先合成巧光氨基酸（通过在侧链上导入巧光基团），然后将其作为一个结构 单元直接用于多肤合成。两种方法各有优缺点，前者是在多肤合成后才考虑导入巧光基团， 它可W直接连到某个氨基酸的残基上，也可W通过搭桥连到多肤的末端，不足之处是巧光 基团的引入有时会影响多肤的生物活性，经常需要优化才能得到理想的标记肤，即耗时，又 耗力；第二种方法可W将巧光基团灵活且准确地标记在多肤的特殊位点上，因此成为多肤 巧光标记领域新的发展方向。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是要解决上述【背景技术】的不足，提供一种具有β-turn模拟物特 性的、基于B0DIPY的巧光氨基酸及其合成方法与应用，该氨基酸不仅可W直接用于多肤的 合成，制备巧光标记多肤，在结构上还可W诱导该多肤形成稳定的β-sheet二级结构。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0008] -种基于B0DIPY的巧光氨基酸，其特征在于，结构通式如下式（I)所示。
[0009]
[0010] 其中，R为-CH3、-H、-F、-Cl、-Br、-I中的一种，
[0011] Ri为-H、-邸3、-邸2邸3、-N03、-F、-C1、-Br、-I中的一种，
[001引尺2为-H、-CH3、-邸2邸3、-N03、-F、-C1、-Br、-I中的一种。
[0013] 优选的，具有如下的结构之一。
[0014]
[0015] 本发明还提供具有上述结构的巧光氨基酸的合成方法，其特征在于，所述合成过 程如下所示。
[0016]
[0017] 其中化合物1为通式（I)中R= -Η、Ri=-Η、R2=-Η时的结构。
[0018] 优选的，合成步骤为：
[0019]a.中间体1-1的制备：
[0020] 氮气气氛下，化咯、苯甲醒、S氣乙酸TFA混合室溫下揽拌l-2h，经后处理得到固 体中间体1-1;
[0021] b.中间体1-2的制备：
[0022] 氮气气氛下，-78°C下将溶有氯代下二酷亚胺NCS的四氨巧喃THF溶液加入溶有 中间体1-1的四氨巧喃THF溶液中，保持-78°C揽拌2-化，室溫继续揽拌3-地，经后处理得 到产物；将得到产物溶于二氯甲烧，加入2, 3-二氯-5, 6-二氯基-1，4-苯酿孤Q，室溫揽拌 l-2h，经后处理得到固体中间体1-2;
[002引C.中间体1-3的制备：
[0024] 氮气气氛下，中间体Ι-2、Ξ乙胺溶于无水二氯甲烧中，加入Ξ氣化棚乙酸溶液，室 溫揽拌12-1化，经后处理得到固体中间体1-3;
[00巧]d.中间体1-4的制备：
[002引中间体1-3、Fmoc保护的氨基乙硫醇、立乙胺在乙腊中室溫反应l-3h，经后处理 得到固体中间体1-4;
[0027] e.中间体1-5的制备：
[0028] 中间体1-4、β-丙氨酸叔下醇醋在乙腊中室溫反应12-1化，经后处理得到固体中 间体1-5 ;
[0029]f中间体1-6的制备：
[0030] 中间体1-5、Fmoc-Osu、^乙胺在二氧六环中室溫反应3-化，经后处理得到固体中 间体1-6 ;
[0031] g.化合物1的制备：
[0032] 将中间体1-6溶于二氯甲烧中，冰浴下加入Ξ氣乙酸，室溫反应2-地，经后处理得 到化合物1 ;
[0033] 上述各步骤中投料比为W下摩尔比：
[0034]a.化咯：苯甲醒：Ξ氣乙酸TFA= 20-25:1:0. 1-0. 2 ;
[0035]b.中间体1-1 :氯代下二酷亚胺NCS:2, 3-二氯-5, 6-二氯基-1，4-苯酿孤Q= 1:2. 2-3:1. 2-2 ；
[0036]C.中间体1-2 乙胺：Ξ氣化棚乙酸=1:2. 2-3:4. 2-5 ;
[0037]d.中间体1-3 :Fmoc保护的氨基乙硫醇：Ξ乙胺=1:1. 2-2:1. 2-2. 4 ;
[00測 e.中间体1-4 :β-丙氨酸叔下醇醋=1:5-7 ;
[0039]f.中间体 1-5 :Fmoc-〇su乙胺=1:1. 2-2:7. 2-8 ;
[0040]g.中间体 1-6 氣乙酸=1:90-100。
[0041] 本发明中室溫范围为：18-30°C [004引优选的，步骤为：
[004引a.中间体1-1的制备：
[0044] 氮气气氛下，化咯、苯甲醒、Ξ氣乙酸TFA混合室溫下揽拌1-化，经化0H溶液泽灭、 萃取、干燥、过滤、浓缩、重结晶得到固体中间体1-1 ;
[0045]b.中间体1-2的制备：
[0046] 氮气气氛下，-78°C下将溶有氯代下二酷亚胺NCS的四氨巧喃THF溶液加入溶有中 间体1-1的四氨巧喃THF溶液中，保持-78°C揽拌2-化，室溫继续揽拌3-地，经加水、二氯甲 烧萃取、干燥、过滤、浓缩得到产物；将得到产物溶于二氯甲烧，加入2, 3-二氯-5, 6-二氯 基-1，4-苯酿DDQ，室溫揽拌1-化，经水洗、萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得 到固体中间体1-2 ;
[0047]C.中间体1-3的制备：
[0048] 氮气气氛下，中间体Ι-2、Ξ乙胺溶于无水二氯甲烧中，缓慢加入Ξ氣化棚乙酸溶 液，室溫揽拌12-1化，经水洗、萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体中间体 1-3。
[0049]d.中间体1-4的制备：
[0050] 将Ξ乙胺加入溶有中间体1-3的乙腊溶液中，再缓慢滴加溶有Fmoc保护的氨基乙 硫醇的乙腊溶液，室溫反应1-化，经加水、二氯甲烧萃取、干燥、过滤、浓缩，硅胶柱层析分离 提纯得到固体中间体1-4 ;
[0051]e.中间体1-5的制备：
[005引将β-丙氨酸叔下醇醋加入溶有中间体1-4的乙腊溶液中，室溫反应12-16h，经加 水、二氯甲烧萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体中间体1-5 ;
[005引f.中间体1-6的制备：
[0054] 将Fmoc-Osu、^乙胺加入溶有中间体1-5的二氧六环溶液中，室溫反应3-化，经加 稀盐酸、二氯甲烧萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体中间体1-6 ;
[0055]g.化合物1的制备：
[0056] 将中间体1-6溶于二氯甲烧中，冰浴下加入Ξ氣乙酸，室溫反应2-地，经加水、二 氯甲烧萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体化合物1。
[0057] 优选的，各步骤投料比为W下摩尔比：
[0058]a.化咯：苯甲醒：Ξ氣乙酸TFA= 25:1:0. 1;
[0059]b.中间体1-1 :氯代下二酷亚胺NCS:2, 3-二氯-5, 6-二氯基-1，4-苯酿孤Q= 1:2. 2:1. 2 ；
[0060] C.中间体1-2 乙胺：Ξ氣化棚乙酸=1:2. 2:4. 2;
[006Ud.中间体1-3 :Fmoc保护的氨基乙硫醇：Ξ乙胺=1:1. 2:1. 2;
[006引e.中间体1-4 :β-丙氨酸叔下醇醋=1:5;
[0063]f.中间体 1-5 :Fmoc-〇su乙胺=1:1. 2:7. 2;
[0064] g.中间体1-6氣乙酸=1:90。
[0065] 本发明基于B0DIPY的巧光氨基酸在合成多肤中的应用。
[0066] 本发明基于B0DIPY的巧光氨基酸作为巧光探针的在多肤与蛋白质互组中的应 用。
[0067] 巧光氨基酸结构的设计包括巧光化合物的选择和结构改造。本发明选择氣棚二化 咯度0DIPY)作为巧光基团，原因主要有两点：一，B0DIPY是性能优良的巧光发色团，与其他 巧光团相比具有高的巧光量子产率、高的摩尔消光系数、良好的光稳定性、双光子吸收好， 可用于活体内检测。二，B0DIPY的骨架结构如下所示，C3与Cs之间的距离为5.2Λ，与天然 β-turn中Rw与RW之间的距离相符，所W在3、5连接多肤最有可能形成β-sheet结构。
[0068]
[0069] 根据上述原因，设计了如下式（I)巧光氨基酸的结构：B0DIPY的8位引入苯环，增 强其稳定性，B0DIPY的骨架结构模拟β-turn的i+1和i巧残基，3, 5位分别用Fmoc保护 的2-氨基乙琉基和2-簇基乙氨基取代，模拟i和i+3残基。
[0070]
[0071] 本发明的有益效果为：将巧光化合物改造成氨基酸类似物，不仅可W直接用于多 肤合成，制备巧光标记多肤，同时在结构上它还可W诱导多肤形成稳定的二级结构，使得到 的巧光多肤具有一定的生物活性，作为探针可W直接用于与蛋白质的相互作用研究，具有 重大的实际应用前景。
【附图说明】
[0072] 图1为化合物2的二氯甲烧溶液的红外光谱图
[0073] 图2为不同溫度下对化合物2氨基氨的核磁位移值图
【具体实施方式】
[0074] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[00巧]本发明中巧光氨基酸的合成策略是首先合成B0DIPY的骨架结构，3、5位进行氯 代，然后分别用Fmoc保护的2-氨基乙硫醇和-丙氨酸分别在3、5位进行亲核取代。
[0076] 实施例1
[0077]a.中间体1-1的制备：
[0078] 取干燥的500ml的两口瓶，瓶内置换成氮气，加入化咯（