一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码基 因与应用。
【背景技术】
[0002] 非生物逆境，如高溫、干旱、高盐、碱性±壤、重金属W及过氧化逆境等，都严重威 胁着农业生产，是造成世界范围内农作物减产的主要原因。植物的生长、发育W及农作物的 产量、品质和后期生长等均受到非生物逆境胁迫的影响，而且全球范围内的主要作物60% 的减产量是由非生物逆境的胁迫所导致。为了确保农作物持续稳定的高产，人类亟需培育 出对干旱、高盐、过氧化等非生物逆境胁迫具有更高耐受能力的作物新品种。但通过传统的 育种方法在改善农作物的性状和抗逆性的进展缓慢，而利用生物基因工程技术则具有良好 的预见性、更高的效率，是培育具有耐逆性农作物新品种最有效的途径。利用现代分子生物 学技术发现新的耐逆境基因，是培育抗逆性农作物新品种的关键所在。
[0003] 干旱和高盐胁迫是限制谷类作物产量增加最主要的两个因素。为了适应运些不利 环境带来的生存压力，植物进化出了多种多样的复杂的生物机制，调节许多逆境相关基因 的表达，试图减少运些逆境对其造成的损伤。运些基因参与到不同的生物途径和过程中，包 括逆境感知和信号转导，从而导致分子、生化、细胞、生理和形态的适应，最终使整个植物发 生响应。到目前为止，已经有大量的逆境相关基因被克隆和鉴定，例如水稻Pro合成酶基因 (0sP5CS;)、水稻Pro转运酶基因（OsProT)、水稻转录因子基因（0SDREB2A)和水稻胚胎晚 期丰富蛋白基因（0SLEA3)。运些基因一旦被激活，则会影响MDA和Pro在细胞中的积累，从 而使植物免受由于高盐、干旱和过氧化物等逆境胁迫所产生的伤害。MDA是反应脂质过氧 化损伤程度最重要的指标。自由Pro的积累则是植物在遭受非生物逆境时最重要的反应机 审IJ，其作用在于通过改变细胞内的渗透势来维持植物的亚细胞结构，从而使植物免受逆境 的伤害。
[0004] 研究显示，大量的PMP3家族基因参与植物对逆境的反应过程。PMP3是一类广泛 存在于在包括酵母、小型动物、水草和高等植物在内的多种生物体内的疏水性小蛋白，且W 多基因家族的形式存在。大量实验结果表明，植物PMP3基因对包括高盐、干旱或者寒冷 等在内的多种逆境有所反应，从而参与植物对逆境胁迫的响应过程。运些基因编码的蛋 白质包括来自大麦的LeESUiXophopyrumelongatum)、来自水稻的 0sRCI2-5、0sLti6a/ b和RIGIB(Oryzasativa)、来自羊草的AcPMP3_l(Aneurolepidiumchinense)、来自水稻 的AtRCI2A/B/D/F(A;r油idopsisthaliana)、来自星星草的PutPMP3-l/-2(Puccinellia tenuiflora)和来自玉米的ZmPMP3-2/3/4狂eamays)。有证据显示，PMP3基因的功能和反 应根据其参与的不同的逆境反应途径而各有不同。例如蛋白质AtRCI2A可能参与水稻在非 生物逆境下不依赖CBF/DREB1信号途径的反应过程，但是水稻中的0sLti6a蛋白则在低溫 逆境条件下受DR邸转录因子的调节。报道显示，植物PMP3基因也能被一些信号分子所诱 导表达，运些信号包括：ΑΒΑ和&〇2,因此我们推测PMP3基因可能在植物ΑΒΑ依赖型逆境反 应过程中也发挥着重要的作用。
[0005] 在酵母中，Pmp化蛋白能够阻止外界环境中的化+离子进入到细胞中，从而起到保 护细胞膜的电位的作用。将植物的PMP3蛋白在酵母中异源表达后，能够弥补pmp3突变体 所缺失的功能，说明植物中的PMP3蛋白可能也具有类似的作用。敲除水稻的AtRCI2A基 因后，突变体植株对盐和化+离子的敏感性增强而在水稻中过量表达AtRCI2A基因则具有 相反的作用。而且，在羊草中，ACPMP3-1基因被定位在具有调节化+和K+离子浓度的根冠 中。虽然人们普遍认为PMP3基因间接参与调控了细胞对离子的吸收，但是其确切的作用机 制仍然有待阐明。由于PMP3蛋白的分子质量普遍较小，它们是不可能形成离子通道的，因 此人们对PMP3蛋白在逆境反应过程中的具体作用仍知之甚少。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种提高植物耐盐耐旱性的蛋白及其编码 基因与应用。
[0007] 所述提高植物耐盐耐旱性的蛋白的序列如SEQIDNO. 1所示，命名为MePMP3-2蛋 白，来源于木署。
[0008] 编码上述蛋白的基因的序列如SEQIDNO. 2所示，命名为MePMP3-2基因。
[0009] 所述植物重组表达载体含有上述的MePMP3-2基因。
[0010] 优选地，所述植物重组表达载体是将所述的MePMP3-2基因插入空载体中而构建 的植物重组表达载体，所述空载体选自抑B、PCAMBIA3301、PCAMBIA1300、PBI121、pBinl9、 PCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或地Y505。
[0011] 优选地，所述植物重组表达载体是将所述的MePMP3-2基因插入到空载体P皿的多 克隆位点而构建的植物重组表达载体，植物重组表达载体的序列如SEQIDNO. 3所示，命名 为P皿：：MePMP3-2植物表达载体。
[0012] 上述蛋白MePMP3-2、上述MePMP3-2基因和上述植物重组表达载体可用于培育耐 旱和耐盐植物。所述植物为为双子叶植物或单子叶植物。所述单子叶植物为水稻。
[0013] 下面对本发明作进一步说明：
[0014] MePMP3-2的氨基酸序列（SEQIDNO. 1)，包括77个氨基酸，该蛋白质的分子 量为8. 65KD，等电点为4. 94。生物信息学分析结果发现，MePMP3-2含有保守结构域 PS01309 ([LIVF] -X- [STAC] - [LIVF] (3) -P- [PF] - [LIVA] - [GAV] - [IV]-X(4) - [GK闲），分别是 SEQIDNO. 1中的第11-27位W及第33-50位的氨基酸组成的结构域。该蛋白质是国际上 未曾报道的新蛋白质。
[0015] SEQIDNO. 2所述序列为编码MePMP3-2的全长cDNA序列，该序列共由743个碱基 组成，其中，5'端未翻译区包括180个碱基，3'端未翻译区包括200个碱基（其中包括第271 位-第399位碱基组成的内含子，不参与该蛋白质的编码），编码区由231个碱基（第181 位-第270位和第400-第543位）组成，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的MePMP3-2 蛋白，编码区中，A占15. 15% (35个），C占25. 54%巧9个），G占21. 21% (49个），T占 38. 09 % (88个），A巧占53. 25 % (123个），C+G占46. 75 % (108个）。数据库捜索氨基酸 与核巧酸序列发现，PMP3基因家族是目前已知基因中与MePMP3-2同源性最高的基因，虽然 核巧酸序列的同源性较低，但是氨基酸的同源性达到53. 8%，初步推测基因MePMP3-2属于 PMP3基因家族。目前为止，尚未发现任何与该基因的相关的研究报道。
[0016] 可用现有的植物表达载体构建含有MePMP3-2基因的重组表达载体。所述植物 表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如P皿、PCAMBIA3301、 PCAMBIA1300、PBI121、地inl9、PCAMBIA2301、PCAMBIA1301-UMN、地Y505 或其它衍生植物 表达载体。
[0017] 使用MePMP3-2基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核巧酸前加上任何一 种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花挪菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、泛 素OJbiquitin)基因启动子（P化i)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动 子结合使用。
[0018] 此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子 或转录增强子，运些增强子区域可W是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需 与编码序列的阅读框相同，W保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子 的来源是广泛的，可W是天然的，也可W是合成的。翻译起始区域可W来自转录起始区域或 结构基因。
[0019] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、 蛋光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是 抗化学试剂标记基因（如抗除莽剂基因）等。
[0020] 上述植物重组表达载体是将上述的MePMP3-2基因插入P皿的多克隆位点，得到的 植物重组表达载体。
[0021] 将上述的MePMP3-2基因导入目的植物，得到耐旱和耐盐转基因植物，所述耐旱和 耐盐转基因植物的耐旱和耐盐性高于目的植物。
[0022] 所述耐旱和耐盐转基因植物为耐高盐、耐甘露醇、耐PEG和/或耐干旱转基因植 物。
[0023] 上述的MePMP3-2基因是通过上述的植物重组表达载体导入目的植物中