一种Protein D与HER2融合蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物学和医学领域，具体地，本发明设及一种可制备肥R2/neu抗原阳 性肿瘤疫苗的融合蛋白，具体而言是一种包括流感嗜血杆菌（化emo地ilusinfluenzae， m)蛋白D(ProteinD，PD)与肥R2/neu肿瘤抗原的融合蛋白。
【背景技术】
[0002] 对于肿瘤的治疗，目前有手术疗法、化学疗法、放射疗法等。手术疗法对于多组织 转移的患者来说，没有治疗意义。化学疗法和放射疗法由于特异性较差会对正常细胞造成 损害。因此临床上需要一种特异性较强的药物，特异性地杀伤肿瘤细胞而对正常细胞不 造成损害。肿瘤免疫疗法是激活体内针对肿瘤抗原的细胞毒性T淋己细泡（cytotoxicT lymphocytes,CTL)，通过被激活的CTL去杀伤表达相应肿瘤抗原的肿瘤细胞，因而具有特 异性。肿瘤特异抗原或相关抗原是研制具有特异性CTL激活作用的生物制品的关键。
[0003] 肥R2是一种肿瘤相关抗原，其编码基因位于人第17对染色体长臂21位（17q21)， 编码跨膜受体样的憐酸化糖蛋白，分子量为185KD，故又被称为P185。P185由1255个氨基 酸组成，其胞外段是由632个氨基酸组成的配体结合域，运个区域富含半脫氨酸；跨膜区是 由22个氨基酸组成的强疏水区，作为膜错定区而使整个蛋白质分子定位在细胞膜上；其胞 内段由580个氨基酸构成，含酪氨酸激酶活性域（Coussens以1985)。
[0004] 通常情况下，肥R2基因主要是在人类的胚胎发育时期表达，参与多种组织器官 的生长发育。在人类成年后，只在一些特定组织中，如：肾脏、肝脏、乳腺组织、卵巢、膜脏、 胃等组织中存在低水平表达。在人类肿瘤中，由于基因产物的过度表达使肥R2/neu的分 子表达发生改变，在20%~30%的侵袭性乳腺癌患者中有肥R2的扩增。此外在卵巢癌 (17-37 % )，非小细胞肺癌（27-56 % )，间质癌（37 % )，膀脫癌（36 % )，食道癌化0-73 % )， 唾液腺癌（32-62% )，原发性肾细胞癌（10% )，膜腺癌（> 50% )中都有其过表达（Slamon DJ，1989;SdineiderPM，1989;WeinerDB，1990;YokotaJ，1988;HouL，1992;Scheurle0， 2000;SeligerB，2000;LipponenP，1994;TagliabueE，2000)。可见，肥R2 的过表达在肿 瘤转化中起积极作用，是肿瘤病因之一。此外，出现在乳腺癌发生早期阶段的肥R2蛋白质 的高表达，也增加肿瘤细胞的转移能力，高表达的肥R2通过启动多种转移相关机制包括提 高：细胞迁移率、体外侵袭力、IV型胶原酶活性、影响某些粘附分子如上皮细胞巧粘蛋白等 的合成而促进转移度lume-JensenP，2001)。因此，肥R2成为肿瘤治疗疫苗的重要标祀之 〇
[0005]抗原的表位（epitope)又称为抗原决定簇，determinant)，它是T细胞抗原受体（T cellreceptor,TCR)和B细胞抗原受体度cellreceptor,BCR)及抗体特异结合的基本 单位。根据与TCR和BCR结合的区别，表位可分为T细胞表位和B细胞表位。由于表位疫 苗缺乏Ξ维结构的分子小、免疫原性差、半衰期短，其不能单独诱导免疫应答，即不具备免 疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫 原性，诱导免疫应答。
[0006] 流感嗜血杆菌PD蛋白是高度保守的表面脂蛋白，作为化的一种特征性毒力决定 因子，流感嗜血杆菌PD蛋白在化引起呼吸道感染过程中起重要作用。人们最初是在研究 化与人I曲骨髓瘤蛋白4490结合时确认流感嗜血杆菌PD蛋白的。对流感嗜血杆菌PD蛋 白编码区DNA进行的序列分析显示，流感嗜血杆菌PD蛋白的成熟蛋白有1092bp的开放读 框编码，由346个氨基酸组成，相对分子质量42000。研究显示，各化菌株中PD蛋白仅存在 很小的变异。核酸和氨基酸水平序列分析显示，各菌株PD具有高度的保守性，并且基因置 换均匀分布于整个基因。分析分离于慢性支气管炎患者不同感染期的化显示，各菌株的流 感嗜血杆菌PD蛋白的基因仅发生很小的突变。采用3种不同的鼠抗PD单克隆抗体进行蛋 白印迹分析发现，PD蛋白存在于所有127株化中，每株细菌表面的PD分子数量约为2800 个。运些研究均证实，流感嗜血杆菌PD蛋白是位于菌体表面的外膜蛋白，具有高度的抗原 保守性，是极具潜力的疫苗候选蛋白。
[0007] 流感嗜血杆菌PD蛋白是一种具有甘油憐酸二醋酶活性的细菌毒力因子，能导致 宿主上皮细胞释放憐酸胆碱。WPD蛋白作为载体蛋白的肺炎链球菌多糖结合疫苗，能预防 肺炎链球菌性耳炎。PD蛋白是迄今为止第一种能在人类机体中诱导保护性应答的不可分型 流感嗜血杆菌抗原，也是最具潜力的多糖结合疫苗候选载体蛋白。
[0008] 流感嗜血杆菌PD蛋白是新型的结合疫苗蛋白载体之一，2009年由葛兰素史克公 司研发的十价肺炎结合疫苗Synflorix在欧洲上市，运个疫苗将1，5和7FΞ个血清型的肺 炎球菌芙膜多糖连接到流感嗜血杆菌PD蛋白上，临床数据表明了其良好的免疫原性和安 全性。
[0009]引起急性中耳炎疾病的两大病源菌是肺炎球菌和无芙膜流感嗜血杆菌，二者都被 认为是下呼吸道感染的主要因素。虽然肺炎球菌芙膜多糖的疫苗应用了很多年，但是对于 儿童的保护性很差。后来，一屯价肺炎多糖疫苗用CRMw作为载体的结合疫苗，能够对儿童 起到保护作用，预防肺炎球菌引起的侵袭性疾病和急性中耳炎。而缺点是CRMw运个载体同 样也用于了Hib和脑膜炎的结合疫苗，因此，同样的载体可能就会对疫苗的免疫力产生负 面的影响。基于W上的原因和流感嗜血杆菌PD蛋白本身的优点，比如说膜定位，序列保守， 分布广泛，致病性和良好的临床前实验结果，都使得流感嗜血杆菌PD蛋白成为了肺炎十价 多糖疫苗的载体蛋白，并可W预防肺炎球菌和无芙膜化b的双重感染。同时在本实验室的 前期工作中W证明利用Hi蛋白作为载体佐剂蛋白，携带外源性表位在添加或者不添加佐 剂后能够诱导动物产生良好的免疫应答。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种可用于制备HER2抗原阳性肿瘤治疗性疫苗的融合蛋 白。
[0011] 肿瘤治疗性疫苗设计初衷是打破由肿瘤细胞引起的机体免疫耐受，由于机体免疫 耐受的影响，使机体免疫系统不能识别非己成分，免疫系统无法识别肿瘤相关抗原，最终导 致免疫抑制。研究报道发现免疫全序列的肥R2蛋白并不能打破免疫耐受，激发免疫应答， 申请人在研究中发现由于全序列肥R2蛋白包含有造成免疫耐受的表位，因而，在肿瘤治 疗性疫苗的设计中，选择截取的部分序列代替全长序列更利于打破免疫耐受，如肥R2胞外 区、跨膜区、胞内区或者一些Tcell表位和Bcell表位。
[0012] 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
[0013] 一种融合蛋白，所述融合蛋白由所述佐剂蛋白通过接头化inker)或直接连接的 方式与肿瘤相关抗原的N端或C端连接形成；其中，
[0014] 所述佐剂蛋白包含流感嗜血杆菌化aemo地ilusinfluenzae,Hi)蛋白D或所述流 感嗜血杆菌蛋白D的片段；
[0015] 所述肿瘤相关抗原包含氨基酸序列为SEQIDNO:3的人肥R2蛋白质或其片段；
[0016] 优选地，所述肿瘤相关抗原由人肥R2抗原胞外区片段和肥R2表位肤片段组合形 成，所述肥R2抗原胞外区片段的氨基酸序列为SEQIDNO:4,所述肥R2表位肤片段的氨基 酸序列为SEQIDNO:5。
[0017] 优选地，所述接头的氨基酸序列为-GGGGSGGGGSGGGGS-;优选地，所述佐剂蛋白通 过直接连接的方式与所述肿瘤相关抗原的N端连接。
[0018] 在根据本发明的一个实施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:6。
[0019] 本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体由编码如权利要求1或2所述 的融合蛋白的核巧酸序列连接商业化载体W及任选地加入酶切识别位点序列和/或 编码蛋白质标签的序列构建而成，所述商业化载体选自美国Merk公司祀T载体系统 如祀T-28a-c(+)、pET29a、祀T-30a-c(+)、祀T39b(+)、祀T-40b(+)、pET-41a(+)W及 祀Τ-43.la(+)中的一种或多种；优选地，所述核巧酸序列为SEQIDN0:7。
[0020] 在根据本发明的一个实施方案中，所述表达载