一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物防治技术领域，特别设及一株对相橘木風具强致病力的宛氏拟青 霉菌株及其应用。
【背景技术】
[0002] 相橘黄龙病是相橘产业上最具毁灭性的病害，能侵染各种相橘类植物，尚无有效 的治疗性药剂，也没有抗（耐）病品种可供应用，当前相橘黄龙病正在全球相橘种植区逐步 蔓延，是世界相橘产业的重大威胁。相橘木風值iaphorinacitrikuwayamae)属同翅目木 風科，主要危害九里香和相橘等芸香科植物，成虫及若虫群集在新梢吸食汁液，被危害的嫩 梢、嫩芽萎缩枯干，新叶崎形易脱落，严重影响植物生长，是相橘上的重要害虫之一。相橘木 風是黄龙病的唯一传播虫媒，相橘木風的频繁发生是相橘黄龙病流行的重要因素。截至目 前，防控相橘黄龙病尚缺乏抗性品种和特效药剂，彻底地控制相橘木風是预防相橘黄龙病 的前提和基础，大面积范围内严格控制相橘木風是黄龙病综合防治的最重要保障。
[0003] 目前对于相橘木風的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了 农药残留、环境污染、天敌昆虫大量死亡、生物多样性被破坏W及昆虫产生抗药性等诸多问 题，而生物防治W其绿色、环保、持效、无污染、不易产生抗药性等优点被人们认为是最有效 和最具应用前景的防治手段。
[0004] 据文献报道，在昆虫病原微生物中，真菌种类最多，约占昆虫病原微生物种 类的60%W上，并且昆虫病原真菌有着显著的流行潜力和生产的便利性，利用昆虫 病原真菌防治相橘木風有着巨大的发展空间。国外已有利用球抱白僵菌Beauveria bassiana度alsamo)Vuillemin、玫烟色棒束抱Isariafumosorosea(Wize)Brownet Smith、枯形被毛抱HirsutellacitriformisSpeare、蜡阶轮枝菌Lecanicillium lecanii狂immermann)Viegas和绿僵菌Metarhiziumanisopliae(Metchnikoff)Sorokin 防治相橘木風的报道，但国内迄今为止，只有张燕敬等开展了利用胡瓜纯缓蛾搭载白僵菌 控制相橘木風的试验研究。因此，进一步分离筛选对相橘木風具有强致病力的虫生真菌，深 入研究其生防潜能，对于促进未来相橘木風的生物防治具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株对相橘木風具 强致病力的宛氏拟青霉菌株。该菌株对相橘木風具有强致病力，具有被开发为生物农药的 潜能，在相橘木風的生物防治方面拥有良好的市场应用前景。
[0006] 本发明的另一目的在于提供所述的宛氏拟青霉菌株的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] 一株对相橘木風具强致病力的宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii)，菌种命名 为GZMS-11，从广东省广州市天河区的九里香（Murrayapaniculata)上采集的相橘木風虫 体上分离获得的。
[0009] 所述的宛氏拟青霉（PaecilomycesvariotiijGZMS-ll的保藏单位：中国典型培 养物保藏中屯、（CCTCC)，保藏日期：2015年10月29日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学， 保藏编号：CCTCCNO:Μ2015651。
[0010] 所述的宛氏拟青霉（Paecilomycesva;riotii)GZMS-ll在防控相橘黄龙病虫媒中 的应用，W及在制备用于防治相橘木風的生物农药中的应用，菌株GZMS-11的分生抱子悬 浮液对相橘木風具有强致病力。
[0011] 所述的宛氏拟青霉（Paecilomycesva;riotii)GZMS-ll，其形态特征、培养特性、 口S1-5. 8SrDNA-ITS2序列和菌种分类结果如下：
[0012] 1、菌株GZMS-11的形态特征：菌株GZMS-11在马铃馨葡萄糖琼脂（PDA)培养基生 长良好，27°C下培养lOd其菌落直径可达5. 86cm。在PDA平板上菌落圆形、蓬松状，起初菌 落白色，后期呈黄褐色，边缘白色。培养lOd的菌落正面为黄褐色棉絮状，菌落背面呈暗褐 色。菌株培养3~4d即产生黄褐色色素，色素扩散至培养基琼脂内。菌丝细长、分隔，分生 抱子梗上生出单个瓶梗或多个瓶梗，形成靑状枝。瓶梗大小2. 5~3. 5X15~20μm，细长 渐尖，稍弯曲，瓶梗着生卵圆形抱子，分生抱子大小5. 5~7. 5X2. 5~3. 5μm。 阳01引 2、菌株GZMS-11的口S1-5. 8SrDNA-ITS2序列：测序所得菌株GZMS-11的 口S1-5. 8SrDNA-ITS2序列如沈QIDNO:1所示，利用NCBIBlast进行比对分析发现， 所测序列与GenBank中宛氏拟青霉（PaecilomycesvariotU)的多个菌株（AY904061.1、 FJ895878. 1、JN798498. 1、AY753335. 1 等）的序列相似性高达 97 ~99 %。
[0014] 3、菌株GZMS-11的菌种分类结果：根据W上关于菌株GZMS-11的形态特征及 口S1-5. 8SrDNA-ITS2序列特征，可将菌株GZMS-11鉴定为子囊菌口（Ascomycota)盘菌亚 口（Pezizomycotina)散囊菌纲巧urotiomycetes)散囊菌亚纲巧urotiomycetidae)散囊 菌目巧urotiales)嗜热子囊菌科（Thermoascaceae)丝衣霉属度yssochlamys)的宛氏拟 青霉（Paecilomycesvariotii)。
[0015] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0016] (1)目前国内外尚未见宛氏拟青霉作为生物农药进行应用的报道，本发明提供的 宛氏拟青霉（Paecilomycesvariotii)菌株GZMS-11是从广东省广州市天河区的九里香上 采集的相橘木風虫体上分离获得的，经测定菌株GZMS-11对相橘木風具有强的致病力。
[0017] (2)本发明所述的宛氏拟青霉菌株GZMS-11是一种昆虫病原真菌，其分生抱子悬 浮液可直接作用于相橘木風，较目前防治相橘木風的化学药剂相比，具有高效、绿色、环保、 持效性强和不易产生抗药性的优点，对环境无污染、无残留；
[0018] (3)菌株GZMS-11生长速度快，产抱量大，抱子萌发率高，易于制备。菌株GZMS-11 在被开发为生防菌制剂用于相橘木風的生物防治上，具有良好的市场应用前景。
【附图说明】
[0019] 图1是菌株GZMS-11在PDA培养基上培养lOd后的菌落特征。
[0020] 图2是菌株GZMS-11的抱子形态。
[0021] 图3是菌株GZMS-11的分生抱子梗形态。
[0022] 图4是试验处理3d后菌株GZMS-11对相橘木風的侵染情况。
[0023] 图5是试验处理7d后菌株GZMS-11对相橘木風的侵染情况。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[002引所述的宛氏拟青霉（PaecilomycesvariotiUGZMS-ll的保藏单位：中国典型培 养物保藏中屯、（CCTCC)，保藏日期：2015年10月29日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学， 保藏编号：CCTCCNO:Μ2015651。
[00%] 实施例1相橘木風病原菌的分离和筛选
[0027] (1)病原菌的分离纯化
[0028] 从广东省广州市天河区的九里香上采集罹病的相橘木風，在实验室超净工作台中 进行操作。先将相橘木風放于70%乙醇中浸泡30s，再经过0. 1 %升隶浸泡Imin，最后用无 菌水冲洗3次。用无菌滤纸吸干虫体上的水分，然后将其放于马铃馨葡萄糖琼脂（PDA)培 养基（配制方法为：称取200g马铃馨，洗净去皮切碎，加水lOOOmL煮沸20~30min，两层 纱布过滤，再加20g葡萄糖和15g琼脂，充分溶解后补水至lOOOmU分装至锥形瓶中，12rC， 高压灭菌20min)中。
[0029] 将培养皿置于微生物培养箱中27Γ恒溫培养，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝 转至新的PDA平板上培养，持续培养lOd左右，待菌落上产生分生抱子，用无菌水洗脱分生 抱子制备成分生抱子悬浮液，然后参照《植病研究方法》中所述的稀释纯化法（方中达.植 病研究方法（第Ξ版）[M].北京：中国农业出版社，1998:122-140)对病原菌进行单抱分 离。最后将分离纯化获得的菌株保存于PDA斜面培养基中，培养7d左右，置于4°C冰箱保 存。
[0030] 似致病菌的筛选
[0031] 将上述分离纯化保存的菌株接种到PDA平板上，于27°C恒溫培养lOd左右后，W 无菌水洗脱菌落上产生的分生抱子，制备获得分生抱子悬浮液，向其中加入适量的吐溫-80 至终浓度为0. 1% (v/v)。取养虫笼内饲养的25头健康相橘木風成虫浸没于含0. 1% (V/ V)吐溫-80的分生抱子悬浮液中10~15s，挑取处理后仍能自由活动的相橘木風置于培养 皿中的九里香叶片上，培养皿底部铺有两层用无菌水浸湿的滤纸，其上放置一个带10个左 右叶片的九里香嫩枝，枝条底端W无菌水浸湿的脱脂棉包裹，然后放于27 + 0. 5°C光照培养 箱中化：D= 14:10,RH〉90% )培养，同时设立含0. 1% (v/v)吐溫-80的无菌水处理相橘 木風