一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质是构成生命体的基本功能单元，其作用机制的解析是理解生物体系功能和 作用机理的关键。X射线晶体学、冷冻电镜和核磁共振（NMR)掲示的蛋白质结构为解析蛋白 质的作用机制提供了直观的证据，而运个过程中的关键步骤是重组蛋白的制备，而无细胞 蛋白翻译系统则为蛋白制备提供了有效的保障。
[0003] 与胞内表达体系相比，无细胞蛋白翻译体系可W表达对细胞有毒害的蛋白质，可 W对蛋白质产物进行同位素标记或者在产物中添加非天然氨基酸，W便于产物的检测和后 续修饰，简化了蛋白产物的后续纯化过程，并缩短了反应时间。
[0004] 无细胞翻译体系由于其具有下述重要优点，最近十年来被广泛的应用于基础研究 和应用研究中：1)无细胞翻译体系操作简单，可W有目的在蛋白质中加入特定标记的氨基 酸，如带有放射性元素等，方便对目标蛋白进行NMR结构或X射线晶体结构的测定；2)在后 基因组时代，蛋白质的高通量表达合成纯化平台具有很重要的意义，无细胞体外表达体系 可W进行大规模的蛋白质合成，为蛋白质组学的研究提供了强有力的工具；3)现有的从组 织中提取医药蛋白的费用昂贵，大大阻碍了医药蛋白质的广泛研究与应用，而无细胞翻译 体系可W大大降低医药蛋白质的制备成本，从而可W普及医药蛋白的广泛应用；4)无细胞 翻译体系还可W用于蛋白质工程或酶工程的研究中，特别是，定向进化是改善蛋白质功能 特性的重要手段之一，建立在无细胞翻译体系基础上的mRNA展示W及核糖体展示等方法 进一步拓宽了蛋白质进化的研究途径；5)无细胞翻译体系有助于膜蛋白的合成表达，膜蛋 白是很多医药分子的祀蛋白，但由于膜蛋白具有特殊结构，难W在细胞内过量表达，其高表 达常常是制约膜蛋白结构和功能研究的重要限制性因素；6)此外，无细胞翻译体系也有助 于类病毒颗粒研究，类病毒颗粒是由一种或多种蛋白质自发组装的复合体，在结构上与病 毒非常类似，可W代替病毒激活免疫系统，由于其不含有遗传物质，因此可W作为安全疫苗 用于临床，体内制备类病毒颗粒由于受制于细胞环境影响，首先制备量有限，其次体内表达 容易被其他体内因子污染，临床应用具有很大的风险，而无细胞翻译体系可W大量制备具 有临床安全性的类病毒颗粒。
[0005] 无细胞翻译体系自身类似于一个蛋白质合成工厂，含有蛋白质合成过程所需要的 各种因子，如转录、翻译、蛋白质折叠和能量代谢等，在此基础上，只要添加合适的翻译模 板，就能合成出相应的蛋白质。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种微生物核糖体的制备方法及其在制备重组蛋白中的应 用。
[0007]本发明提供了一种制备核糖体的方法（方法甲），包括步骤（a);所述步骤（a)为 制备核糖体粗提液；所述制备核糖体粗提液依次包括如下步骤：
[0008] (al)取微生物，进行高压细胞破碎，然后离屯、收集上清液；所述高压为500PaW上 的压力（具体可为600化压力）；
[0009] (a2)取步骤（al)得到的上清液，通过硫酸锭沉淀的方式去除杂蛋白，然后离屯、收 集上清液（核糖体粗提液）；所述"通过硫酸锭沉淀的方式去除杂蛋白"中的硫酸锭浓度为 1. 5M。
[0010] 所述步骤（al)中，将所述微生物悬浮于菌体悬浮液并加入面asel，然后进行所述 高压细胞破碎；所述菌体悬浮液如下：溶剂为抑7. 6、25mM的化is-HCl缓冲液；溶质及其浓 度为：15mMMgCl2、150mMKC1 和 7mM0 -mercaptoethanol。 W11] 所述步骤（al)中，所述离屯、的条件为：4°C、1500化pm离屯、30分钟。
[0012] 所述步骤（a2)中，所述"通过硫酸锭沉淀的方式去除杂蛋白"的条件为：4°C揽拌 30分钟。 阳01引所述步骤姐）中，所述离屯、的条件为：4°C、15000巧m离屯、30分钟。
[0014] 所述方法还包括步骤化）；所述步骤化）为：取步骤（曰2)得到的上清液，通过 化化apBu切1FF疏水层析柱纯化核糖体。
[0015] 所述步骤化）中，纯化核糖体的方法如下：取步骤（a2)得到的上清液，过滤除菌 (具体可采用0.45微米滤膜过滤除菌）后上样于化TrapBu切1FF疏水层析柱，用溶液II 进行洗脱并收集洗脱峰；
[0016] 所述溶液II由1体积份缓冲液A和1体积份缓冲液B组成；
[0017] 所述缓冲液A如下：溶剂为抑7. 6、25mM的Tris-肥1缓冲液；溶质及其浓度为： 15mMMgCl2、150mMKC1、1.5M(NH4)2S04和TmMP-mercaptoethanol;
[0018] 所述缓冲液B如下：溶剂为抑7. 6、25mM的Tris-肥1缓冲液；溶质及其浓度为： 15mMMgCl2、150mMKC1 和TmMP-mercaptoethanol。
[0019] 所述步骤化）中，上样后、用溶液II进行洗脱前还包括如下步骤：用溶液I进行洗 脱直至基线平缓。所述溶液I由4体积份所述缓冲液A和1体积份所述缓冲液B组成。
[0020] 所述步骤化）中，用溶液II进行洗脱的流速为2ml/min。
[0021] 所述方法还包括步骤（C);所述步骤（C)为：取步骤化）收集的溶液，通过薦糖梯 度离屯、纯化核糖体。
[0022] 所述步骤（C)中，纯化核糖体的方法如下：取离屯、管，先加入1体积份薦糖缓冲液， 然后加入1体积份步骤化）收集的溶液，使两者之间形成分界面；然后取所述离屯、管，放入 45Ti超离屯、转子（具体可为45Ti超离屯、转子）中，离屯、取沉淀；
[0023] 所述薦糖缓冲液如下：溶剂为抑7. 6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为： 15mMMgCl2、150mMKCl、7mMβ-mercaptoethanol和质量百分含量为 30%的薦糖。
[0024] 所述步骤（C)中，所述离屯、的条件为：4°C、36000巧m、离屯、10小时。
[0025] 所述方法还包括步骤（d);所述步骤（d)为：将步骤（C)得到的沉淀溶于核糖体保 存缓冲液，得到核糖体溶液；所述核糖体保存缓冲液的溶剂为抑7. 6、20mM的化pes-KOH缓 冲液；溶质及其浓度为：15mMMgCl2、150mMKC1 和 7mM0 -mercaptoethanol。 阳0%] 所述微生物可为嗜热栖热菌，具体可为嗜热栖热菌皿8。
[0027] 本发明还提供了一种制备核糖体的方法（方法乙），依次包括如下步骤： 阳02引 （1)取30g嗜热栖热菌皿8的菌体，加入30ml菌体悬浮液和2微升面aselW悬浮 菌体，然后采用高压细胞破碎仪在600化压力下进行细胞破碎，然后4°C、15000巧m离屯、30 分钟，收集上清液；
[0029] 所述菌体悬浮液如下：溶剂为抑7. 6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为： 15mMMgCl2、150mMKC1 和 7mMβ-mercaptoethanol;
[0030] (2)取步骤（1)得到的上清液，加入硫酸锭至浓度为1. 5M，4°C揽拌30分钟，然后 4°C、15000巧m离屯、30分钟，收集上清液；
[0031] (3)取步骤（2)得到的上清液，用0. 45微米滤膜过滤除菌，得到滤液；
[0032] (4)将步骤（3)得到的滤液上样于化TrapBu切1FF疏水层析柱，用溶液II进行洗 脱并收集洗脱峰；
[0033] 所述溶液II由1体积份缓冲液A和1体积份缓冲液B组成；
[0034] 所述缓冲液A如下：溶剂为抑7. 6、25mM的Tris-肥1缓冲液；溶质及其浓度为： 15mMMgCl2、150mMKC1、1.5M(NH4)2S04和 7mMP-mercaptoethanol;
[0035] 所述缓冲液B如下：溶剂为抑7. 6、25mM的Tris-肥1缓冲液；溶质及其浓度为： 15mMMgCl2、150mMKC1 和 7mMβ-mercaptoethanol;
[0036] 妨取离屯、管，先加入1体积份薦糖缓冲液，然后加入1体积份步骤（4)收集的溶 液，使两者之间形成分界面；
[0037] 所述薦糖缓冲液如下：溶剂为抑7. 6、25mM的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为： 1511111旨(：12、15〇11111((：1、711110-1116'。日9如6地日11〇1和质量百分含量为3〇%的薦糖；
[0038] (6)完成步骤（5)后，取所述离屯、管，放入45Ti超离屯、转子中，4°C、36000巧m、离屯、 10小时，取沉淀；
[0039] (7)将步骤（6)得到的沉淀溶于核糖体保存缓冲液，得到核糖体溶液； W40] 所述核糖体保存缓冲液的溶剂为抑7. 6、20mM的化pes-KOH缓冲液；溶质及其浓度 为：15mMMgCl2、150mMKC1 和 7mMβ-mercaptoethanol。
[OOW 所述步骤（4)中，上样后、用溶液II进行洗脱前还包括如下步骤：用溶液I进行洗 脱直至基线平缓。所述溶液I由4体积份所述缓冲液A和1体积份所述缓冲液B组成。 [0042] 所述步骤（4)中，用溶液II进行洗脱的流速为2ml/min。
[00创所述步骤（1)中，所述"嗜热栖热菌皿8的菌体"的制备方法具体如下：
[0044] ①挑取嗜热栖热菌皿8的一个单菌落，接种至25ml嗜热栖热菌培养基，60°C、 20化/min振荡培养12-18小时（具体可为15小时），得到种子液； W45] ②取步骤①得到的种子液