一种适合昆虫细胞Sf-9的无血清无动物源培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物制药技术领域，具体设及一种适合昆虫细胞Sf-9的无血清无动 物源培养基的制备。
【背景技术】
[0002] 杆状病毒表达系统化aculovirusexpressionsystem)是近年来应用较多的真核 表达系统，它可W在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆 状病毒是一类W昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊 椎动物，对人、畜无害。杆状病毒表达系统的主要优越性有如下特点：
[0003] ①表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键；
[0004] ②翻译后可进行修饰加工如糖基化、憐酸化、酷胺化及信号肤切割等，使重组蛋白 在结构和功能上更接近天然蛋白； 阳〇化]③与其他真核表达系统相比，杆状病毒表达系统可W高效表达外源基因，表达量 最高可达被感染昆虫细胞总蛋白量的50% ;
[0006] ④可W容纳大片段外源基因。
[0007] 目前研究较多的是首猜银纹夜蛾核多角体病毒（AcNPV)，其宿主是草地贪夜 蛾，而Sf-9细胞，正是杆状病毒表达系统的宿主细胞之一。Sf-9细胞，即：Spodoptera 化ugiperda(草地夜蛾）卵巢细胞，是由G.E.Smith和C.L.化er巧在1983年从细胞株 IPLB-SF21AE得来的一个克隆。IPLB-SF21AE是1977年由Vau曲η等从草地夜蛾蛹的 卵巢组织得到的。Sf-9细胞属于半贴壁型细胞系，可W进行悬浮培养，也可W进行贴壁培 养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点。早些年间Sf-9细胞的培养基常 为TNM-iW培养液，即在Grace'SAntheraea培养液的基础上，每升培养液加3. 3g酵母粉和 3. 3g乳白蛋白水解物，用1MK0H调抑到6. 2-6. 4过滤除菌，完整培养液在使用前加入10% 热灭活的胎牛血清。
[0008] 相对于添加血清的培养，无血清悬浮培养是最为先进的工艺。无血清培养基相比 有血清培养基具有诸多优势：1)可避免血清的外源性污染，因为动物来源血清常携带病毒 或支原体；2)可克服血清批次间的差异性，使细胞培养性能更加稳定，能提高结果的重复 性；如成分相对明确，有利于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等一系列细胞行 为；4)可简化下游目的产物的分离纯化，节省成本。
[0009] 目前，国外的无血清培养基产品价格高且配方保密，同时国内外均缺少专口针对 昆虫细胞Sf-9细胞培养的无血清培养基，而且培养基性能较差，不能持续的维持细胞的活 力，或者是成本较高。己斯福股份公司申请的中国专利申请公开号CN1498267A，其所生产 的培养基为液体培养基，对于运输和放菌要求极高，并且价格昂贵，不适合我国的目前的培 养基发展状况。本发明基于上述状况，开发了适合Sf-9悬浮生长的纯固体培养基，特别是 将一些脂类经过了特殊处理之后，能W固体的形式加入到培养基中，并且使细胞能够获得 24化的连续生长，细胞活力能保持在95%W上。
【发明内容】
[0010] 本发明目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种针对我国工业生产所用昆虫细 胞Sf-9细胞的生长的特点，研制适合Sf-9细胞高密度悬浮培养的低成本、无血清、无动物 源、低蛋白培养基。通过添加脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等组分来替代血清 的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基 组分的优化，使Sf-9细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适 合于规模化工业生产。
[0011] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种适合悬浮培养Sf-9细 胞的无血清无动物源培养基，其特征在于，所述培养基中包括下列含量的原料物质：
[0012] (1)氨基酸部分： 阳〇1引 k丙氨酸lOO-SOOmg/l,
[0014] 心谷氨酷胺 900-5500mg/l，
[0015] k精氨酸盐酸盐 700-2500mg/l，
[0016] 心天冬氨酸 900-1700mg/l,
[0017] 心天冬酷胺SOO-lSOOmg/l，
[0018] k半脫氨酸一水合物120-320mg/l，
[0019] k谷氨酸l3〇〇-28〇Omg/l,
[0020] 心异亮氨酸 40〇-l3〇Omg/l，
[0021] k亮氨酸 3〇〇-75〇mg/l，
[0022] k赖氨酸盐酸盐 400-1600mg/l，
[0023] k蛋氨酸 600-1650mg/l,
[0024] k苯丙氨酸 700-1800mg/X, 阳0巧]k脯氨酸 300-1000mg/l，
[0026] k丝氨酸 200-1050mg/l,
[0027] k苏氨酸 200-900mg/l，
[0028] k色氨酸 100-400mg/l,
[0029] k酪氨酸二钢盐 200-900mg/l，
[0030] k鄉氨酸 300-980mg/l，
[0031] k脫氨酸盐酸盐50-85mg/l，
[0032] k组氨酸盐酸盐 100-250mg/l，
[0033] k赖氨酸 300-1000mg/l,
[0034] 甘氨酸 200-900mg/L; 阳0对 似无机盐部分：
[0036] 四水钢酸锭0. 01-加邑/1，
[0037] 无水氯化巧 100-950mg/l，
[0038] 氯化钢 1000-7500mg/l,
[0039] 憐酸氨二钢 10-45mg/l，
[0040] 六水氯化儀 500-800mg/l,
[0041] 无水硫酸儀 200-900mg/l，
[0042] 氯化钟 400-2350mg/l,
[0043] 一水憐酸二氨钢 800-1500mg/l,
[0044] 屯水合硫酸锋0. 1-0. 7mg/l，
[0045] 亚砸酸钢 0.01-0. 〇3mg/l,
[0046] 硫酸亚铁0. 01-0.加邑/1，
[0047] 碳酸氨钢 100-900mg/L; W48] 0)维生素部分：
[0049]生物素 0.005-0.Olmg/l, 阳化0]维生素B12 0. 1-0.Smg/l,
[0051] 氯化胆碱 0.S-Smg/l,
[0052] D-泛酸巧0. 2-加邑/1，
[0053] 叶酸 0. 2-5mg/X,
[0054] 烟酷胺 5-8mg/l， 阳化5] 盐酸[I比唉醇5-8mg/l,
[0056] 憐酸化唉醒 0.oe-o. 3mg/l，
[0057] 核黄素 0. 08-0. 6mg/l，
[0058] 钻胺素 0. 04-3mg/l，
[0059] 盐酸硫胺素 0. 05-0. 5mg/l， 柳6〇]肌醇 5-8mg/L;
[0061] (4)脂类添加部分： 柳创 亚油酸0. 1-0. 3mg/l， 阳〇6；3] 大豆卵憐脂IS-Wmg/l, 柳64]胆固醇 20-60mg/l， 阳0化]腐胺 0. 04-0.Smg/X,
[0066] 乙醇胺 5-40mg/l，
[0067] 无水乙醇 0. 5-2ml/L;
[0068] (5)水解物添加部分：
[0069] 大豆水解物 500-4000mg/l,
[0070] 酵母超滤物 500-4000mg/l,
[0071] 大米水解物 500-2000mg/l，
[0072] (6)其余添加物部分：
[0073] D-葡萄糖 3〇0〇-6〇OOmg/l,
[0074] 丙酬酸钢 10〇-25〇mg/l， 阳0巧]硫辛酸0.OS-O.emg/l，
[0076] 胸巧 0. 06-0. 5mg/l,
[0077] 腺嚷岭 0.l-5mg/l，
[0078] 胸腺喀晚 0. 02-2mg/l，
[0079] 重组膜岛素3-25mg/l，
[0080] 巧樣酸铁 0. 02-lmg/l，
[0081] 环庚Ξ締酪酬 0.l-8mg/l，
[0082] F-68 50-600mg/l,
[0083] 还原型谷脫甘肤0. 01-0. 9mg/l，
[0084] 次黄嚷岭钢盐0.l-5mg/L。
[0085] 其中，F-68是pluronicF-68的简称，在细胞培养过程中的常用添加物，对细胞具 有保护作用。
[0086] 关于"大豆水解物"、"酵母超滤物及"大米水解物"在本领域中有公认的含义， 就是将大豆，酵母，大米，经过特殊的工艺，包括酶消化、酸处理等手段进行处理后，提取适 合细胞生长组分，目前均有商品化试剂，本发明具体使用的是Difico公司生产的水解物。
[0087] 本发明的优点及有益效果如下：本发明提供一种适宜悬浮培养Sf-9细胞的无血 清、无动物源培养基，它是一种低成本的、适用于Sf-9细胞悬浮培养的无血清、无动物源、 低蛋白培养基，通过一些脂类、维生素、微量元素等成分的添加，特别是通过Ξ种水解物的 添加和优化，完全替代了血清的功能，显著促进了细胞的增殖速度，并使细胞能保持较高的 活力。本发明开发了适合Sf-9悬浮生长的纯固体培养基，特别是将一些脂类经过了特殊处 理之后，能W固体的形式加入到培养基中，并且使细胞能够获得24化的连续生长，细胞活 力能保持在95%W上。
[0088] 为实现上述发明目的，本发明采用的另一个技术方案是针对于工业化生产而配置 的一种悬浮培养昆虫细胞Sf-9的无血清无动物源培养基的固体实现方法，其特征在于，所 述配制方法包括如下工艺步骤：
[0089] 第一步，在容器中加入注射用水（水溫25°C)至总体积的90% ;
[0090] 第二步，将上述混合好的培养基加入容器中，轻微揽拌溶解；
[0091] 第Ξ步，轻微揽拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100% ;
[0092] 第四步，用Imol/L氨氧化钟溶液或Imol/L盐酸溶液调抑至6. 2 ;
[0093] 第五步，用0. 2μm滤膜正压过滤除菌；
[0094] 第六步，溶液配制完成后应在2-8°C下密闭避光保存。 阳0巧]本发明开发了适合Sf-9悬浮生长的纯固体培养基，特别是将一些脂类经过了特 殊处理之后，能W固体的形式加入到培养基中，并且使细胞能够获得24化的连续生长，细 胞的峰值浓度可达1300万/毫升，细胞活力能保持在95%W上。
【附图说明】
[0096] 图1 :Sf-9细胞在本发明所提供的培养基JYK-SF9中的生长情况。
[0097] 图2 :对照组1，即Sf-9细胞在Gibico培养基SF900II当中的生长情况。
[0098] 图3 :对照组2,即Sf-9细胞在苏州沃美培养基SF-SFM当中的生长情况。
【具体实施方式】
[0099] 实施例1.无血清、无动物源、低蛋白培养基的制备
[0100] 本实施例是一种适合Sf-9细胞悬浮培养的无血清无动物源低蛋白培养基 (JYK-S巧），它包括22种氨基酸，12种无机盐，12种维生素，6种脂类，3种蛋白水解物，12种 添加物；所用材料如无特殊说明均购自sigma公司。具体成分如下： 阳1〇1] (1)氨基酸部分： 阳 1〇2]k丙氨酸lOO-SOOmg/l,
[0103] 心谷氨酷胺 90〇-55〇Omg/l，
[0104] k精氨酸盐酸盐 700-2500mg/l， 阳1〇5] 心天冬氨酸90〇-l7〇Omg/l,
[0106]心天冬酷胺SOO-lSOOmg/l， 阳1〇7] k半脫氨酸一水合