一种适合bhk-21细胞转瓶培养的低血清培养基及其配制方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药及生物制品制造技术领域，具体涉及一种适合BHK-21细胞转瓶 培养的低血清培养基及其配制方法。
【背景技术】
[0002] BHK-21细胞是世界卫生组织和中国生物制品规程认可的生产疫苗的细胞系，它 具有来源广，生物安全性高，对多种病毒的感染敏感，病毒增殖滴度高等优点。连续传代的 BHK-21细胞系可W用于多种病毒的增殖和纯化，如口蹄疫病毒，脑必肌炎病毒，呼肠孤病 毒，水疮性口炎病毒等。中国工业生产的狂犬疫苗系，口蹄疫疫苗系和伪狂犬疫苗系等全部 或者部分采用BHK-21细胞生产。目前，中国的生产工艺多采用MEM培养基添加10 %的小牛 血清转瓶贴壁培养，由于目前中国血清供应日益紧张伴随着价格不断走高，对中国疫苗生 产企业产生了明显的限制。此外，从生产的角度来讲，血清中含有大量成分复杂的蛋白质， 送极不利于疫苗、细胞因子和单克隆抗体等生物制品的下游纯化分离，同时血清所含的化 学成分不确定，血清也存在批次稳定性问题，而且还容易引起细菌、真菌、病毒和支原体污 染。因此，尽量不用或少用血清成为BHK-21细胞培养的趋势，现有技术常通过添加牛血清 白蛋白、转铁蛋白、膜岛素等动物源成分，来降低血清的添加量，但是动物源成分的蛋白质 对生物制品（如疫苗）的安全性有很大影响，所W迫切需要一种适合于BHK-21细胞转瓶培 养的低血清低蛋白的培养基，既能够使细胞快速生长，保持较高的活力，又减少了污染的可 能，提高细胞产品的稳定性，同时减少动物来源的蛋白组分含量，利于后期纯化工艺，降低 生产成本。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于，克服现有技术中的缺陷，提供一种适合BHK-21细胞贴壁生长的 低血清培养基，在常规的转瓶培养中，血清用量由常规的10%大幅降低至1%，并且细胞生 长速度更快，所能达到的细胞密度更高，同时保持了较高的活力。培养基研制过程中，用一 些具有特殊功能的化合物、脂类成分、酵母和植物水解物W及重组蛋白代替了培养基中常 规添加的动物源成分，在降低血清成本的同时，减小了培养基中血清和动物源蛋白携带外 源病原菌污染的机率，同时培养基中的蛋白含量大幅减少，十分有利于后期纯化工艺，提高 细胞产品的稳定性。
[0004] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是；提供一种适合BHK-21细胞转瓶 培养的低血清培养基，其特征在于，在常规培养基（DMEM)的基础上，添加了激素、脂类、微 量元素和水解物成分，用W替代血清的部分功能，用于降低血清的添加量，添加成分及含量 如下：
[0005] 亚砸酸钢 0. 005-0. 03mg/L;
[000引氨化可的松0. 01-0.Img/L;
[0007]前列腺素 0. 01-0.Img/L;
[000引 Η贿甲状腺原氨酸0. 001-0.Olmg/L;
[0009] 亚油酸 0. 1-0. 3mg/L;
[0010] 大豆卵磯脂 15-20mg/L;
[0011] 胆固醇 3-lOmg/L;
[0012] 腐胺 0. 04-0. 8mg/L;
[001 引 己醇胺l-20mg/L;
[0014] 棉巧水解物 300-3000mg/L;
[0015] 大米水解物 300-3000mg/L;
[0016] 麦款水解物 300-3000mg/L;
[0017] 丙丽酸钢 50-300mg/L;
[001引 重组膜岛素2-25mg/L;
[0019] 巧樣酸铁 0. 05-lmg/L;
[0020] 环庚Η帰酪丽 0.l-6mg/L;
[0021] F-68 100-600mg/L；
[0022] 还原型谷脫甘肤0. 04-0. 5mg/L。
[0023] 利用W上所述成分可W替代血清的部分功能，从而在促进细胞的生长的前提下降 低BHK-21细胞在转瓶贴壁培养中血清的添加量。本发明研制的低血清培养基不仅降低了 培养基成本，而且还大幅减少了培养基中动物源蛋白的含量，更有利于细胞下游产品的分 离和纯化。
[0024] 其中前列腺素为前列腺素E1。
[0025] 其中Η贿甲状腺原氨酸为Η贿甲状腺原氨酸T3。
[0026] 其中优选的技术方案是，所述培养基为DMEM培养基，编号为Ρ0240。DMEM培养基 为上海源聚生物有限公司生产的培养基。
[0027] 为实现上述发明目的，本发明采用的另一个技术方案是一种上述适合ΒΗΚ-21细 胞转瓶培养的低血清培养基的配制方法，其特征在于，所述配制方法包括如下步骤：
[002引步骤1 ;在容器中加注射用水至总体积的90%，将DMEM培养基全部倒入容器中，用 适量注射用水将袋内残留培养基洗下并入容器，轻微揽拌溶解；
[0029] 步骤2 ;将上述组分依次加入到溶液中，轻微揽拌溶解；
[0030] 步骤3 ;轻微揽拌至完全溶解，加注射用水至总体积的100% ;
[0031] 步骤4 ;用Imol/L氨氧化钢溶液或Imol/L盐酸溶液调抑至7. 2 ;
[003引步骤5 ;用0. 2μm厚的滤膜正压过滤除菌；
[0033] 步骤6 ;溶液配制完成后应在2°C~8°C下密闭避光保存。
[0034] 其中优选的技术方案是，所述步骤1中注射用水的水温为25t：。
[0035] 优选的技术方案还有，所述一袋DMEM培养基的体积为200ml。
[0036] 本发明的优点及有益效果是，该培养基通过激素、脂类、微量元素、水解物等的添 加，大幅降低了培养基中血清的添加量，即使在血清浓度低至1%的情况下，相比较传统的 MEM+10%FBSW及市售的低血清培养基MD611+3%FBS，更能促进细胞快速生长，增加细胞 密度，缩短倍增时间，提高细胞活力，说明该发明培养基更适合于BHK-21细胞的低血清转 瓶培养。
【附图说明】
[0037] 图1为实施例2，BHK-21细胞在发明培养基（JYK-LSM)+1%FBS中的生长情况，A: 细胞生长图示；B;细胞生长曲线。
[003引 图2为对照组1，BHK-21细胞在MEM+10%FBS中的生长情况。A;细胞生长图示； B;细胞生长曲线。
[0039] 图3为对照组2，BHK-21细胞在MD611+3%FBS中的生长情况。A;细胞生长图示； B;细胞生长曲线。
【具体实施方式】
[0040] 实施例1
[0041] 本发明是一种适合BHK-21细胞转瓶贴壁培养的低血清培养基（JYK-LSM)及其配 制方法，所述培养基是W上海源聚生物科技有限公司生产的P0240培养基（DMEM)作为基础 培养基添加了无机盐、激素、脂类、微量元素、水解物等成分，所用材料如无特殊说明均购自 sigma公司，具体添加物及含量如下：
[0042] 亚砸酸钢 0. 005mg/l，
[0043] 氨化可的松0.Olmg/l，
[0044] 前列腺素E10.Img/l，
[0045] Η贿甲状腺原氨酸灯3)0.Olmg/l，
[0046] 亚油酸 0.Img/l，
[0047] 大豆卵磯脂15mg/L，
[004引胆固醇3mg/L，
[004引 腐胺 0. 8mg/L，
[0050] 己醇胺 20mg/L，
[0051] 棉巧水解物800mg/l，
[0052] 大米水解物3000mg/L,
[0053] 麦款水解物300mg/l，
[0054] 丙丽酸钢 50mg/L，
[005引 重组膜岛素25mg/L，
[0056] 巧樣酸铁 0. 05mg/L,
[0057] 环庚Η帰酪丽6mg/l，
[0058] F-68lOOmg/L,
[0059] 还原型谷脫甘肤0. 04mg/L。
[0060] 实施例2
[0061] 本发明是一种适合BHK-21细胞转瓶贴壁培养的低血清培养基（JYK-LSM)及其配 制方法，所述低血清培养基是上海源聚生物科技有限公司生产的P0240培养基（DMEM)作为 基础培养基添加了无机盐、激素、脂类、水解物等成分，所用材料如无特殊说明均购自sigma 公司，具体添加物及含量如下：
[0062] 亚砸酸钢 0. 015mg/l，
[0063] 氨化可的松0. 04mg