一种用于鲆鲽鱼类淋巴细胞增殖的培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于培养基制备技术领域，具体设及一种用于解蝶鱼类淋己细胞增殖的培 养基。
【背景技术】
[0002] 鱼类是已知兼具固有与获得性免疫最低等的脊椎动物，也具有完全的体液和细 胞免疫应答。淋己细胞作为鱼类血液免疫中的主要细胞类型，在鱼类整体免疫系统中具有 十分重要的作用。
[0003] 鱼类体外淋己细胞大量增殖培养，不仅为传统的鱼类细胞遗传学研究提供了充足 的材料，同时也为现今鱼类分子免疫学研究奠定了基础。
[0004] 为了使鱼类淋己细胞在体外高效大量增殖，培养基的成分至关重要。传统的基础 培养基为鱼类淋己细胞的生存提供了基本的条件，其中包括适宜的PH值和渗透压，为鱼类 淋己细胞的生存提供了一切所需的营养因子，其中包括氨基酸、维生素、无机盐等，同时也 是鱼类淋己细胞各种代谢产物的排放场所。传统基础培养基的优点是价格低廉，易于获得， 但是传统基础培养基的缺点是鱼类淋己细胞增殖效率非常低，细胞活力指数低，不能满足 鱼类细胞遗传学和分子免疫学的研究。 阳〇化]针对传统基础培养基在培养鱼类淋己细胞方面的弊端，近年来有尝试通过添加有 丝分裂原、血清和k谷氨酷胺来提高鱼类淋己细胞增殖效率的尝试，但增殖效率及细胞活 力指数都不高，尚没有商品化的鱼类淋己细胞培养基。如何获得高效鱼类淋己细胞增殖培 养基仍未得到解决。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种适应于解蝶鱼类淋己细胞增殖的培养基W及应用，该培 养基可W使淋己细胞高效增殖，细胞活力指数高，该培养基具有良好的稳定性，可W完全满 足鱼类分子免疫学W及细胞遗传学培养淋己细胞的需求。
[0007] 本发明提供的解蝶鱼类淋己细胞增殖培养基，是在基础培养基中添加刀豆蛋白 A(ConA)、细菌脂多糖（LP巧、植物血球凝集素（PHA-P)、美洲商陆凝集素（PWM)、解蝶鱼血 清、胎牛血清、混合脱氧单核巧酸、k谷氨酷胺和碳酸氨钢制成的。
[0008] 所述的基础培养基是能够提供维持解蝶鱼类淋己细胞生存的最基础环境条件和 营养物质的培养基，
[0009] 作为实施例的优选，基础培养基是DMEM培养基、L-15培养基或199培养基； 阳010] 上述培养基中刀豆蛋白A(ConA)的使用浓度为l-80yg/ml，优选地，其使用浓度 为2-60μg/ml，更优选地为20μg/ml。
[0011] 本发明中细菌脂多糖（LP巧，其使用浓度为5-800μg/ml，优选地，其使用浓度为 10-500μg/ml，更优选地为 100μg/ml。
[0012] 本发明中植物血球凝集素（PHA-P)，其使用浓度为0. 5-40μg/ml，优选地，其使用 浓度为2-30μg/ml，更优选地为2μg/ml。 阳01引本发明中美洲商陆凝集素（PWM)，其使用浓度为3-50μg/ml，优选地，其使用浓度 为 5μg-40μg/ml，更优选地为 5μg/ml。
[0014]本发明中解蝶鱼血清，其使用的体积百分含量为2 % -20 %，优选地，其使用的体 积百分含量为5 % -15 %，更优选地为5 %。
[0015] 本发明中胎牛血清，其使用的体积百分含量为1% -30%，优选地，其使用的体积 百分含量为5 % -20 %，更优选地为10 %。
[0016] 本发明中混合脱氧单核巧酸，其使用浓度为lOmmol/L。
[0017] 本发明中心谷氨酷胺，其使用的体积百分含量为1%。
[0018] 本发明中碳酸氨钢，其使用浓度为1. 2g/L。
[0019] 本发明的培养基中还添加抗生素，包括青霉素和链霉素，青霉素使用浓度为 lOunits/ml，链霉素使用浓度为lOyg/ml。
[0020] 本发明提供的培养基含有解蝶鱼血清及各种促进淋己细胞增殖的有丝分裂原，通 过各成分的有效配比，能够使淋己细胞高效快速增殖，淋己细胞活力指数高，平均增殖活力 高达85. 33%，同时该培养基具有良好的稳定性，可W完全满足鱼类分子免疫学和细胞遗传 学培养淋己细胞的需求。
【具体实施方式】
[0021] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 阳02引实施例1 :培养基的制备
[0023] 本实施例的培养基，其制备步骤如下：
[0024] 1)无菌条件下将DMEM培养基干粉在电子天平上砰取后置于灭菌容器内，添加无 菌水稀释后揽拌混匀获得DMEM液体培养基； 阳0巧]2)将刀豆蛋白A(ConA)加入培养基，加入的终浓度为20ug/ml; 阳0%] 3)将细菌脂多糖（LP巧加入培养基，加入的终浓度为lOOug/ml;
[0027] 4)将植物血球凝集素（PHA-巧加入培养基，加入的终浓度为化g/ml;
[0028] 5)将美洲商陆凝集素（PWM)加入培养基，加入的终浓度为加g/ml;
[0029] 6)将混合脱氧单核巧酸加入培养基，加入的终浓度为lOmmol/L;
[0030] 7)将碳酸氨钢加入培养基，加入的终浓度为1. 2g/L; 阳03U 8)将青霉素加入培养基，加入的终浓度为lOunits/ml;
[0032] 9)将链霉素加入培养基，加入的终浓度为lOug/ml;
[0033] 10)将解蝶鱼血清加入培养基，加入的体积百分含量为5% ;
[0034] 解蝶鱼血清制备方法：取体重800g左右的解蝶鱼类，用不加入抗凝剂的无菌针管 抽取血液10ml，20°C室溫放置地，lOOOg离屯、20min，取上清液，即为血清。也可W采用已经 公开的其它制备鱼类血清的方法来制备。
[0035] 11)将胎牛血清加入培养基，加入的体积百分含量为10% ;
[0036] 12)将k谷氨酷胺加入培养基，加入的体积百分含量为1 % ;
[0037] 13、充分混匀后置负压过滤除菌；
[0038] 14、调节培养基抑值为7. 0 + 0. 2。
[0039] 培养基配制完成后，需封口冷藏（-20°C)备用。
[0040] 使用本发明提供的培养基进行解蝶鱼类淋己细胞培养，淋己细胞分裂比例高、分 裂速度快、细胞活力强，平均增殖活力高达85. 33%。
[0041] 实施例2、本发明培养基的培养
[0042] 采用实施例制备的本发明的培养基；对比培养基配方：L15或199 ;89. 9%，胎牛血 清10%，双抗0. 1%。
[0043] 淋己细胞培养方法：无菌条件下抽取2ml解蝶鱼类血液，加入等体积FIC0化淋己 细胞分离液，24°C、20(K)rcf离屯、比后吸出中间淋己细胞层，PBS洗涂淋己细胞后加入培养 基，置于24°C培养箱中培养72小时，每隔9小时左右轻轻摇动培养皿一次，W促进细胞增殖 生长。
[0044] 染色体制备：采用常规染色体制备技术进行染色体制备，具体包括秋水仙素处理 2小时，氯化钟低渗液处理30分钟，卡诺固定液预固定10分钟，继续固定3次，每次20分 钟。染色体材料冷藏（-20°C)备用。
[0045] 结果发现本发明的培养基，染色体分裂相特别多；而对比培养基，分裂相特别少， 几乎找不到染色体。
[0046] 实施例3、解蝶鱼类淋己细胞增殖活力检测
[0047] 采用本发明的培养基。 W4引 对比培养基配方：L15或199 89. 9%，胎牛血清10%，双抗0. 1%。
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