一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒及其制备和应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及合成生物学技术，尤其涉及一种可融合水疱性口炎病毒糖蛋白膜颗粒以及其制备和在传递生物大分子和细胞器中的应用。
【背景技术】
[0002]研究发现，某些疾病，例如苯丙酮尿症，由于缺乏相关的蛋白酶，导致了患者出现异常症状；而另外一些疾病，例如神经退行性阿尔茨海默病，俗称老人痴呆症，与线粒体功能异常有莫大的关系。虽然，利用药物投递系统来实现治疗的目的已经取得重大的进展，然而，这些系统还不能有效地解决现有问题。
[0003]目前已经建立了多种药物投递系统，例如，纳米颗粒可以通过包装或者共轭结合的方式实现治疗性蛋白质和多肽的传递，但是，复杂的制作流程、药物活性的下降、和难以突破内体的障碍无不限制着这种系统的广泛应用；另外，蛋白的传递还可以通过外来体(exosome)和微泡(microvesicle)实现，从而克服操作流程繁琐的问题；而通过水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)纳米膜颗粒和利用逆转录基质蛋白Gag得到的VSV-G类病毒体来传递目的蛋白，克服了内体的障碍并提高了传递的效率。然而VSV-G纳米膜颗粒太小，不能包裹更大的物质，例如是线粒体，线粒体的大小可以到微米级。
[0004]与生物大分子传递系统相比，细胞器传递系统进展十分缓慢和有限。研究发现，线粒体可以自发地通过细胞膜纳米管道(membrane nanotubles)在细胞之间传递，而且能够恢复线粒体缺陷型细胞的有氧呼吸功能；线粒体显微注射也可以实现线粒体传递，但是严格的操作要求和特殊的仪器设备不适用于批量制备；另外，利用放线菌素D (actinomycinD)可以使细胞功能性“去核”，成为含有线粒体的胞质体，但是有些细胞不受药物影响，仍然保留核功能；最近有研究报道，利用细胞穿膜肽(CPP)也可以有效传递体外分离的线粒体。但是传递效率比较低。
[0005]由于目前传递生物大分子和细胞器的投递系统存在传递效率低，费时费力和生物安全性等问题，因此，建立一种高效传递生物大分子和细胞器的方法，对于治疗多种疾病有重大的意义。
【发明内容】
[0006]本发明的第一目的在于提供一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，可实现生物大分子和细胞器的有效传递。
[0007]为了解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案:
一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，所述细胞膜颗粒在细胞膜上表达水疱性口炎病毒糖蛋白；所述细胞膜颗粒包裹生物大分子和细胞器；所述细胞膜颗粒不具有细胞核、细胞核DNA和核蛋白。水疱性口炎病毒糖蛋白具有融膜功能。包裹生物大分子包括mRNA，microRNA，线粒体DNA，细胞质蛋白，细胞膜蛋白等生物大分子。
[0008]进一步的，所述细胞膜颗粒包裹蛋白质和线粒体。能够有效包裹线粒体，并且传递到靶细胞中发挥功能。
[0009]进一步的，所述细胞膜颗粒大小为3Mm~5Mm。在传递物质过程中，纳米颗粒的大小是比较适合传递物质的，例如是蛋白质和一些小分子药物，而颗粒越大，传递的效率会有所下降。但是，纳米颗粒大小的缺点是不能包裹更大的物质，例如是线粒体，线粒体的大小可以到微米级，为了解决这样的问题，必须要制备更加大的颗粒，才能有效包裹线粒体。本发明的细胞膜颗粒为3-5 μ m，虽然在传递效率上有所降低，但是可以包装更多的物质，同时保证一定的传递效率；而且在膜颗粒上包裹了水疱性口炎病毒蛋白融膜蛋白，提高了膜颗粒进入内体后释放线粒体的效率，从而大大地提高了线粒体的转递效率，解决了包裹线粒体的问题，实现高效快速的细胞器的传递。
[0010]本发明的第二目的在于提供一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的制备方法，包括以下步骤:
(1)用表达水疱性口炎病毒蛋白质粒对Ad293细胞进行瞬时转染；
(2)转染48h后，用胰酶消化细胞，离心3min后得到悬浮的表达水疱性口炎病毒糖蛋白的细胞；
(3 )将步骤(2 )所得细胞悬液置于针筒，并将针筒安装到已安置聚碳酸酯膜的针头式过滤器中，推动针管使细胞悬液从过滤器一边推出到另外一边，获得表达水疱性口炎病毒糖蛋白的细胞膜颗粒。
[0011]胰酶是一种蛋白酶，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞间结合处和细胞-培养皿处蛋白降解，这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞分开。
[0012]进一步的，所述步骤(1)包括以下步骤:
(11)将lmg的表达水疱性口炎病毒蛋白质粒加入离心管中，加入50μ 1无血清培养液将混匀；
(12)将3mlPolyjet转染试剂和50ml的无血清培养液加入另一离心管中，轻轻摇勾；然后加入步骤(12)所得溶液中；得到转染混合液，室温静置5-10min ;
(13)吸去培养液，并补加1ml新鲜无血清培养液，把转染混合液马上加入到Ad293细胞，轻轻摇匀；
(14)12h后更换新的培养液。
[0013]Polyjet转染试剂是一种可生物降解的高分子聚合物的DNA转染试剂，Polyjet试剂能在电泳期间低浓度固定脱氧核糖核酸迀移，并在5分钟内形成转染复合体。能够在转染聚合物细胞内吞后迅速并完全降解聚合物，这样可大大降低细胞毒性。
[0014]进一步的，每lxlO6的Ad293细胞，用lmg的表达水疱性口炎病毒蛋白质粒转染。
[0015]进一步的，所述聚碳酸酯膜孔径大小为3μπι ;所述过滤器为25mm可换膜针头式过滤器。聚碳酸酯膜上面布满直径大小为3μπι的圆，有利于形成形态完整、大小均匀的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒。
[0016]本发明的第三目的在于提供一种表达融膜蛋白的细胞膜颗粒在传递生物大分子和细胞器中的应用。将目的生物大分子和细胞器传递到生物大分子和细胞器缺陷的细胞中。表达融膜蛋白的细胞膜颗粒能够有效包裹线粒体，并且传递到靶细胞中发挥功能。可以把目的生物大分子和细胞器传递到生物大分子和细胞器缺陷的细胞中，恢复细胞的正常功能。
[0017]与现有技术相比，本发明的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒颗粒更大，包裹和传递更多的物质，不但能包裹生物大分子和线粒体，而且在功能上能够传递蛋白质和线粒体，并使传递的物质行使正常的功能。制备时不需要添加额外化学试剂，有效维持了水疱性口炎病毒蛋白的生物活性，制备时采用的Polyjet转染试剂能在电泳期间低浓度固定脱氧核糖核酸迀移，并在5分钟内形成转染复合体，所形成的聚合物能够在转染聚合物细胞内吞后迅速并完全降解聚合物，这样可大大降低细胞毒性。制备得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的大小均匀、形态完整。本发明首次用25_可换膜针头式过滤器、注射器和孔径大小为3Mm的聚碳酸酯膜快速方便制备直径大小约为3 Mm的水疱性口炎病毒蛋白质粒细胞膜膜颗粒，这种膜颗粒可以包裹蛋白质和线粒体，降低蛋白质线粒体在体外传递过程中的降解，虽然颗粒比纳米颗粒更大，但可以包装更多的物质，同时保证一定的传递效率；而且在膜颗粒上包裹了融膜蛋白水疱性口炎病毒蛋白，提高了膜颗粒进入内体后释放线粒体的效率，从而大大地提高了线粒体的转递效率，这不但为研究生物大分子和细胞器缺陷相关的疾病奠定了基础，而且对于研究细胞核质关系有重要意义。
【附图说明】
[0018]图1为本发明表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的制备方法示意图；
图2为本发明表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的表征图，其中293/EGFP，293/Mi to，和293/H2B分别表示表达胞质绿色荧光蛋白的293细胞，表达线粒体绿色荧光蛋白的293细胞和表达细胞核H2B蛋白和绿色荧光蛋白的融合蛋白的293细胞，最左边一排图为细胞拼合图，其它三排从左到右依次为细胞膜颗粒的明场、绿色荧光蛋白和拼合图；
图3为本发明pLP-VSVG (表达水疱性口炎病毒蛋白)和pDsRed-Expressed (表达红色荧光蛋白的质粒)共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与Ad293靶细胞孵育后的荧光鉴定图，a为孵育后5h的荧光照片，b为孵育后12h的荧光照片；
图4为本发明pLP-VSVG和pDsRed-Expressed共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒的效率统计图；
图5为本发明pLP-VSVG和pCMV (CMC启动子)_CreER共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与pCMV-DSRed/l0XP2/DSRed (Loxp系统的报告基因)受体细胞孵育48h后的荧光照片，从左到右分别为DsRed (红色荧光蛋白)、EGFP (绿色荧光蛋白阳性)和拼合图；
图6为本发明pLP-VSVG和pCMV-CreER共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与pCMV-DsRed/loxP2/DsRed受体细胞孵育48h后EGFP细胞与DsRed阴性细胞的比例统计鉴定图；
图7为本发明pLP-VSVG和pMito-EGFP (表达能进入线粒体的绿色荧光蛋白)共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒，与靶细胞孵育后5h和12h的荧光照片图8为本发明pLP-VSVG和pMito-EGFP共转染Ad293细胞而得到的表达融膜蛋白的细胞膜颗粒传递的效率统计图；
图9为本发明去除溴化乙锭(EB)、丙酮酸(pyruvate )、尿苷(uridine )后，线粒体缺陷型细胞HeLa RhoO (线粒体缺陷型)与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行线粒体形态荧光染色鉴定图，从左到右依次为明场、线粒体染色试剂和拼合图； 图10为本发明去除溴化乙锭(EB)、丙酮酸(pyruvate)、尿苷(uridine)后，线粒体缺陷型细胞HeLa RhoO与VSV-G细胞膜颗粒孵育，并在第5天进行线粒体膜电位荧光染色鉴定图，从左到右依次为明场、绿色、红色和拼合图；
图11为本发明去掉溴化乙锭(E