一种用于军团菌快速检测与分型的引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物分子检测领域，尤其设及一种用于军团菌快速检测与分型的引 物及方法。
【背景技术】
[0002] 军团菌（Ze知〇化?心3)是一种兼性细胞内寄生菌，广泛存在于自然界、人工水体 和±壤环境中。目前已经确认的军团菌属有58种，包括有70多个血清型，并不断有新 的菌种从环境中分离出来。现代研究发现，约有一半的军团菌种与人类疾病有关，其中 约90%军团菌感染是由嗜肺军团菌（Ze知〇打6心3 /wey曲口如j7a)引起，其中W血清型1 型的嗜肺军团菌（Ze知oneiia/we歴OjOAiiaserogroupl)感染居多，占所有军团菌感染 病例的85%左右。除此之外，约10%的军团菌感染由非嗜肺军团菌导致。在非嗜肺军 团菌感染中，60%的感染病例由麦氏军团菌（Zegioneiia曲如泌沁。引起，其次为杜氏 军团菌任6知〇/?6心3沁曲〇/巧从博兹曼军团菌（Ze知oneiia 长滩军团菌 任6知o"e77。7〇。幼eacAsey)和菲氏军团菌任6知o"e77。/ee7eiiy)等弓I起。
[0003] 尽管在全球范围内的非嗜肺军团菌感染病例中，大部分由麦氏军团菌感染引起， 但是长滩军团菌感染在一定的区域内占据主导，如澳大利亚，新西兰，泰国，日本等地军团 菌感染病例中长滩军团菌感染占所有军团菌感染病例的30-50%。军团菌通过空气W气溶胶 的形式感染人，引起军团菌性肺炎，严重威胁人类的健康。因此，建立一种能检测军团菌并 能将检出的军团菌分型为常见致病性军团菌的方法具有重要的临床意义。
[0004] 目前军团菌感染及军团菌的检测方法主要有血清抗体检测、尿可溶性抗原检测、 军团菌分离培养等。但是上述的检测方法存在检测时间长、阳性率低、培养基的配置复杂和 价格昂贵的缺陷，不利于军团菌的快速检测。近年来，分子生物学的发展为微生物的分类鉴 定工作提供了较简便和准确的方法。多重PCR方法具有很高的特异性与敏感性，其主要是 通过检测军团菌中的特异基因，W达到快速检测军团菌的目的。
[0005] 中国专利CN102140514B公开了一种检测嗜肺军团菌多种血清型致病菌特异性引 物及试剂盒，所述试剂盒可同时检测5种血清型嗜肺军团菌，而且该检测方法周期短、速度 快、可操作性强，其检测结果与经提取得到的DNA作为模板扩增所得的结果一致，是一种理 想的嗜肺军团菌多种血清型致病菌的检测方法。但是，该检测方法的检测对象只针对嗜肺 军团菌，不利于对非嗜肺军团菌的检测。
[0006] 中国专利申请201410607389. 6公开了一种快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团 菌的Ξ重PCR检测方法，所述检测方法主要是针对军团菌种属、嗜肺军团菌种和嗜肺军团 菌I型的leSrRNA、dani和0RF9Ξ个基因的引物，对dNTPs和引物浓度比例W及退火溫度 进行优化，建立快速区分非嗜肺、嗜肺与嗜肺I型军团菌的Ξ重PCR方法，该检测方法可W 对分离培养到的军团菌菌株进行快速有效的判定。但是，该检测方法只对特定军团菌菌株 进行分型，检测范围较狭窄，而且特异性不强，不利于该检测方法的推广和应用。
【发明内容】
[0007] 为解决现有技术中军团菌的检测方法存在检测范围窄、特异性不强的缺陷，本发 明提供了一种用于军团菌快速检测与分型的引物及方法，W解决上述问题。
[0008] 本发明提供了一种用于军团菌快速检测与分型的引物，其包括军团菌属特异引物 和嗜肺军团菌种特异引物、嗜肺军团菌血清型1型特异引物、长滩军团菌特异引物、麦氏军 团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物；所述 军团菌属特异引物为： Gk388F :5' -GGAGGGTTGATAGGTTMGAGC-3'(沈Q ID NO. 1)， 化-388R:5' -CCAACAGCTAGTTGACATCGT-3'(沈Q ID NO. 2); 所述嗜肺军团菌特异引物为： LP-229F :5' -TCCGATGGTCAAGTGCGT-3'(沈Q ID NO. 3)， LP-229R :5, - TGAAGGGACTTGATGTGGCA-3'(沈Q ID NO. 4); 所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物为： LPsgl-wzt-93F :5> -GCCACTGCCTTCATCCATT-3'(沈Q ID NO. 5)， LPsgl-wzt-93R: 5' -CGCAAAGCCCAGAAATGAT-3'(沈Q ID NO. 6); 所述长滩军团菌特异引物： llo0050-567F :5' -GCGCGCTGGTAATCCTAATA-3'(沈Q ID NO. 7)，llo0050-567R:5' -TTGCTGCACGTACTGTCTT-3'(沈Q ID NO. 8); 所述麦氏军团菌特异引物为： Lmgy^-785F:5'-TGCATTTMCCATTCGTCGTAAC-3'GEQIDN0.9)， Lmgy巧-785R:5, -AGTCATTTCTCTTGCTTTGCGA-3'(沈Q ID NO. 10); 所述博兹曼军团菌特异引物为： 化gy巧-692F :5' -AATGCCTTATCCGAGGAAT-3'(沈Q ID NO. 11)， 化gy巧-692R:5' -TCAGCAACACTGGACTCAA-3'(沈Q ID NO. 12); 所述杜氏军团菌特异引物为： LdgyrB-471F :5, -TTCGGGTGTATGCATTCAC-3，（沈Q ID NO. 13)， LdgyrB-471FR:5, -TCAGCAACGCTGGATTCAA-3'（沈Q ID NO. 14); 所述菲氏军团菌特异引物为： Lfgy巧-293F :5, -CAGAAGAGTTACATCTATCGATTCA-3'(沈Q ID NO.巧）， Lfgy巧-293R :5, -AAAGGCCTGAATTCCTCCC-3'(沈Q ID NO. 16)。
[0009] 进一步地，所述16条引物同时存在于同一反应体系中的浓度分别为：Gk388F、 化-388R、LP-229F和LP-229R的浓度为150-300nM ;LPsgl-wzt-93F、LPsgl-wzt-93R、 llo0050-567F、llo0050-567R、Lmgy巧-785F、Lmgy巧-785R、化gy巧-692F、化gy巧-692R、 Lfgy巧-293F、LfgyrB-293R和Ldgy巧-471F的浓度为200-350nM ;LdgyrB-471R的浓度为 400-600nM。
[0010] 更进一步地，所述16条引物同时存在于同一反应体系中的浓度分别为： 化-388F、化-388R、LP-229F和LP-229R的浓度为200nM ;LPsgl-wzt-93F、LPsgl-wzt-93R、 llo0050-567F、llo0050-567R、Lmgy巧-785F、Lmgy巧-785R、化gy巧-692F、化gy巧-692R、 LfgyrB-293F、LfgyrB-293R和Ldgy巧-471F的浓度为250nM ;LdgyrB-471R的浓度为500nM。
[0011] 进一步地，所述军团菌属特异引物的祀基因为16srRNA基因，嗜肺军团菌特异引 物的祀基因为1PP0267基因，嗜肺军团菌血清型1型特异引物的祀基因为wzt基因，长滩军 团菌特异引物的祀基因为11〇0050基因，所述麦氏军团菌特异引物、博兹曼军团菌特异引 物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物的祀基因均为gy巧基因。
[0012] 另外，本发明还提供了一种用于军团菌快速检测与分型的方法，包括如下步骤： S1应用细菌基因组DNA提取液提取待测标本中的细菌基因组DNA ; S2 W细菌基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的军团菌属特异引物和嗜肺军团 菌种特异引物、嗜肺军团菌血清型1型特异引物、长滩军团菌特异引物、麦氏军团菌特异引 物、博兹曼军团菌特异引物、杜氏军团菌特异引物和菲氏军团菌特异引物进行多重PCR扩 增； S3将阳性对照液和阴性对照液同时进行多重PCR扩增； S4将所得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
[0013] 进一步地，所述步骤S1中细菌基因组DNA提取液的配方为：化elex100resin 5〇/〇;Tris-肥1 10mM，p册.3;乙二胺四乙酸二钢0. 1ml;叠氮钢0. 1 %;蛋白酶Κ200yg/ mlο
[0014] 进一步地，所述步骤S2中的PCR扩增反应条件包括：阶段1 :94°C3min;阶段2 : 94°C25s;阶段3:55°C25s;阶段4:72°C40s;35个循环；阶段5:72°C5min;在4°C胆存。
[0015] 进一步地，所述步骤S2中军团菌属特异引物扩增的序列为388bp，所述嗜肺军团 菌特异引物扩增的序列为229bp，所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物扩增的序列为93bp， 所述长滩军团菌特异引物扩增的序列为56化P，所述麦氏军团菌特异引物扩增的序列为 78化P，所述博兹曼军团菌特异引物扩增的序列为69化P，所述杜氏军团菌特异引物扩增的 序列为47化P，所述菲氏军团菌特异引物扩增的序列为293bp。
[0016] 其中，所述军团菌属特异引物（Gk388F)-(化-388R)扩增的序列为388bp，该序 列为军团菌属16SrDNA基因一段保守序列，具体序列如下：
所述嗜肺军团菌特异性引物（LP-229F) - (LP-229R)引物对扩增的序列为229bp，该序 列为嗜肺军团菌lpp〇267基因内一段保守序列，具体序列为：
所述嗜肺军团菌血清型1型特异引物对（LPsgl-wzt-93F)- (LPsgl-wzt-93R)扩增的 序列为93bp，该序列为嗜肺军团菌血清型1型wzt基因一段保守序列，具体序列如下： GCCACTGCCTTCATCCATTGCACAAGAAGGTAGAACTGTAGTCGATGCAAGTCAAATTAGCCCGGAATATCCC AATCATTTCTGGGCTTTGCG； 所述长滩军团菌特异引物对（1l〇0050-567F) - (1lo0050-567R)扩增的序列为56化p， 该序列为长滩军团菌11〇0050基因上一段保守序列，