一种水稻基因启动子、表达盒、表达载体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种水稻基因启动子、表达盒、表达载体及其 应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是位于结构基因转录起始位点上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与 模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。目前应用于植物研究中的启动子，按其作 用方式及功能可分为3类，即组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。
[0003] 组成型启动子可W在植物的各种组织中启动基因表达。目前在植物中应用最广的 是组成型动子，如CaMV35S启动子等。然而，外源基因的持续高效表达，产生的大量异源蛋 白质或其他代谢产物在植物体内累积，不仅造成物质与能量的浪费，而且还打破了植物本 身的代谢平衡，影响植物的正常生长发育过程，甚至于一些产物对植物有毒而导致其死亡。 为了使外源基因更加有效地发挥作用，减少对植物的不利影响，组织特异性启动子的研究 越来越受到人们的重视。
[0004] 组织特异性启动子仅在特定的组织及一定的发育时期才可W启动基因的表达。近 年来，植物组织特异性启动子已被大量研究，并且在农作物的分子遗传改良领域得到了广 泛的应用。Simlhu等利用Gtl基因启动子将菜豆球蛋白基因特异表达于水稻种子的胚乳 中，获得了高蛋白质含量的水稻种子。Borisjuk等利用根特异启动子mas2'，使目的基因只 在烟草的根细胞中表达。Kasuga等利用rd29A启动子驱动来自拟南芥的转录因子DREB1A 或CBF1，在转基因拟南芥中表达，有效地提高了转基因植株的抗寒性，而且对植物的生长影 响甚微。BeU-Lelong等发现C4H启动子能够诱导木质素在拟南芥的茎中特异性表达，从 而避免了木质素对其他组织的伤害。W上特异性启动子驱动外源目的基因在植物中定位表 达，不仅减轻了对植株的不利影响，而且还能提高目的产物在特定部位的表达量，增强转基 因的效果。
[0005] 随着转基因育种技术的快速发展，人们对启动子的要求也不断变化。目前越来越 多的研究倾向于特异性表达的启动子，在满足各种不同研究需求的同时，尽可能避免物质 和能量的浪费，减少外源基因在非目的组织中过度表达所造成的损失。水稻rbcS基因启动 子受光诱导调控，使外源基因在绿色组织中特异表达，且在叶片中表达量较高。水稻AL1基 因启动子能够调控外源基因在胚乳表层中的传递细胞层区域的表达，从而改善种子从母体 的营养吸收W及防御病原入侵。化yS1基因的启动子则能够诱导外源基因在水稻的花粉 中特异性表达。
【发明内容】
[0006] 在水稻基因组忍片分析的基础上，本课题组筛选到1个在水稻中组织特异性表达 的基因0sMTG3 (GENBANK号码AK121385)。通过生物信息学分析，该基因上游1. 8化的DNA 片段为候选启动子区域，将其命名为P〇sMTG3。通过克隆、测序鉴定后，将其连接到表达载 体PC31P1中，得到与GUS基因融合表达的表达载体PC31Plp3。通过农杆菌介导法将构建的pOsMTG3启动子表达载体转化水稻，对转基因株系进行GUS组织化学染色分析，验证启动子 的表达特异性，为其进一步应用于水稻分子改良育种提供重要的数据参考。目P，本发明提供 了一种水稻基因启动子、表达盒、表达载体及应用。
[0007] 本发明通过如下技术手段达到上述目的：
[0008] 所述水稻基因启动子序列如SEQIDNO. 1所示，命名为p0sMTG3启动子。所述启 动子用于在水稻的茎、穗、根和芽中表达目的基因。
[0009] 用于扩增上述启动子的引物对包括：
[0010] 引物p0sMTG3-F:5' -TCTAGACTCTACGTGTTCGAGCAATGCC-3'（沈QIDNO. 3);
[0011] 引物p0sMTG3-R:5, -AAGCTTACGCTATGGAGAGCTTG-3'（SEQIDNO. 4)。
[0012] 所述表达盒包含上述启动子，W及目的基因，所述目的基因与所述启动子连接。所 述目的基因位于所述启动子的3M则。
[0013] 所述表达载体含有权利要求1所述的启动子。
[0014] 所述表达载体还含有目的基因，所述目的基因与所述启动子连接。
[0015] 所述目的基因位于所述启动子的3M则。所述目的基因为GUS基因。
[0016] 所述表达载体序列如SEQIDNO. 2所示，命名为表达载体PC31Plp3。
[0017] 下面对本发明作进一步说明：
[0018] 本发明公开了一个来自于水稻的特异p0sMTG3启动子，通过对含有重组基因 p0sMTG3-GUS的转基因植株的不同部位进行GUS染色分析表明，该启动子在茎、穗、根和芽 中表达，而在叶片中不表达。王利军等发现atslA基因启动子可启动外源基因在转基因烟 草的叶片中特异性高效表达，Marraccini等发现RBCS1基因启动子可驱使报告基因在叶中 特异性高效表达，而P〇sMTG3是1个在叶片中特异性不表达的启动子，此类型启动子在国内 外鲜有报道，具有一定的应用价值。
[0019] 通过基因忍片筛选特异性表达的基因，克隆其启动子并进行功能试验，是获得特 异性启动子的一大途径。本发明通过水稻基因组忍片分析筛选得到的0SMTG3基因在水 稻根、茎、穗中优势表达，而在叶片中不表达，具有一定特异表达的特征。利用生物数据库 PLACE对该基因p0sMTG3启动子序列分析表明，p0sMTG3具有启动子发挥功能至关重要的顺 式作用元件，其中TATA盒保证转录的正确定位，而CAAT盒则控制转录起始的频率。除此之 夕F，该启动子还含有一些可能与耐逆境相关的保守元件，其中，ABRELATERD1、MYCATERD1和 MYB2C0N沈NSUSAT可能参与0sMTG3基因对干旱胁迫的响应，而LTREC0REATC0R15能够调节 低溫、干旱和ΑΒΑ等逆境响应基因的表达，GATA盒在植物光诱导和硝酸盐诱导基因的转录 过程中起作用。
[0020] 叶片作为水稻主要的营养器官，通过光合作用提供植株生长的能量，在水稻的生 长发育过程中起着至关重要的作用。而外源基因在受体植株的表达往往会引发一系列不可 预测的负面影响，极大地影响转基因植物的正常生长和发育。本发明表明，p〇sMTG3启动子 能够启动外源基因在水稻根、茎、穗中优势表达，而在叶片中不表达，可W确保外源基因在 根、茎或果实中正常表达的同时，对叶片功能的影响相对较低，为水稻生长发育提供充足的 物质和能量来源。运在国内外尚没有相关的报道，为转基因水稻的研究提供了一种全新的 启动子。 阳02U 本发明WGUS基因作为目的基因为例，表达盒就是pOsMTG3启动子和该目的基因 (GU巧相连接，不再在两者之间要插入其他基因。启动子的意义就在于，像一个开关一样， 控制与其相连的基因的表达与否，GUS基因只是起到一个指示作用，把启动子是否工作W- 个比较直观的方式显现出来（GUS染色结果，有蓝色表示开关工作，没有蓝色表示开关不工 作）。该启动子在除叶子W外的部位都是工作的，该启动子之后可W连接任何其他外源的目 的基因。 阳〇2引总之，本发明利用水稻基因忍片筛选得到1个在水稻多组织表达的基因0SMTG3，且该基因在孕穗期受干旱处理时表达量上调，而在抽穗期受低溫处理时表达量下调。把该 基因ATG密码子上游1. 8化左右的DNA片段预测为启动子区，并将其命名为pOsMTG3。用 PCR技术克隆该启动子，并WGUS基因作为报告基因，在水稻中分析了该启动子在不同组织 中的表达特性。GUS组织化学染色分析表明：pOsMTG3启动子主要在水稻根、茎、穗中优势表 达，而在叶片中不表达。由于P〇sMTG3启动子未检测到在水稻叶片中的表达，可用于特殊水 稻品种的研发，而不影响光合作用等叶片的重要功能。
【附图说明】 阳〇2引图1为表达载体PC31Plp3T-DNA的结构图；图中Tnos为终止子；
[0024] 图2为不同逆境下水稻0SMTG3基因在叶片和穗中的相对表达水平图；图中1、2和 3分别代表苗期、孕穗期、抽穗期；L代表叶片，P代表穗；K代表无处理对照，C代表低溫，D 代表干旱；
[0025] 图3为p0sMTG3启动子PCR产物（a)及PC31Plp3载体化）酶切鉴定图；图中Μ代 表DNAMarker;1代表PCR或酶切产物；PC31P1代表空表达载体； 阳026] 图4为p0sMTG3启动子的序列和结构图；图中方框内序列代表引物序列；下划线 代表保守元件;Δ坚代表基因翻译起始位点；
[0027] 图5为转基因水稻植株的PCR鉴定图；图中Μ代表DNAmarker;N代表无模板阴性 对照；W代表野生型9311阴性对照；P代表阳性植株对照；1~14代表被检测植株；
[0028] 图6为p0sMTG3-GUS转基因水稻植株不同组织器官GUS活性的组织化学染色分析
[0029] 图；图中A、C、E、G为转基因植株，B、D、F、Η为野生型9311对照植株。
【具体实施方式】
[0030] 1材料和方法
[0031] 1.1水稻材料
[0032] 供试水稻为釉稻品种9311W及培矮64S(化yzasativaL. )。W培矮64S为基因 忍片分析的材料，培矮64S基因组DNA作为克隆启动子的模板，9311作为转化受体品种。
[0033] 1. 2菌株、质粒、酶与试剂
[0034]大