新疆野扁桃自交不亲和ssk基因的克隆及双元表达载体的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学的分子标记领域，具体设及一种新疆野扁桃自交不亲和 SSK基因的克隆及其双元表达载体的构建方法。
【背景技术】
[0002] 新疆野生扁桃[(PrimustenellaBatsch,Synonym,AmygdalusLedebouriana Schleche)]俗称野己旦杏，该野生种是地史新生代的残遗物种，为菩薇科李亚科桃属扁桃 属植物。该物种自然稀少地分布于欧洲东南、亚洲中西部山区。在我国的新疆塔城地区裕 民境内有2000hm2连片成林的新疆野生扁桃自然保护区；同时，还面积不等地分布于塔城市 郊、托里县W及阿尔泰山脉的布尔津县和哈己河县，授粉生物学表明野生扁桃具有自交不 亲和性。
[0003] 植物自交不亲和性（self-incompatibility,SI)是指在花期相遇的情况下，同 一植株或基因型相同的植株的花柱特异性识别自己花粉，并抑制花粉管生长的一种遗传机 审IJ。菩薇科果树的绝大多数树种为自交不亲和，自花授粉不结实，在生产过程中必须进行异 花授粉。因此，为了提高产量，生产上需要配置授粉树，运用蜜蜂授粉或进行人工授粉，运不 仅费时费力，而且增加了果园的生产成本，使得果树生产程序复杂化。扁桃是我国新疆天 山W南地区的特色干果树种之一，商业栽培前景广阔。但产量低运一生产难题一直制约着 运一优势资源的产业化开发，其中多数新疆扁桃品种的自交不亲和性是在导致其低产的瓶 颈。据多年的调查和研究，新疆是栽培扁桃的原生物种起源中屯、之一，而新疆分布的野生扁 桃林是研究世界扁桃起源、进化W及品种改良的重要种质资源基因库。有学者认为中国新 疆塔城野生扁桃林自然保护区和比邻的哈萨克斯坦国的野生扁桃林可能是扁桃的起源中 屯、。而在新疆南部栽培的扁桃品种种类繁多，南疆栽培扁桃自交不亲和，抗寒抗旱和抗病性 较弱，而新疆野生扁桃有一定比例的自花结实率，抗寒抗旱和抗病性很强，植株也很矮小， 那么野生种和栽培种是否可W通过杂交和转基因育种等方法获得自交亲和、矮化和抗逆性 强的新品种？诸如此类问题，值得进一步探讨研究。
[0004] SI不仅为研究植物生殖细胞间信号识别和转导、细胞间相互作用和基因时空 表达提供了一种理想模型，而且在作物遗传改良和杂种优势利用上具有重要价值。植物 自交不亲和主要分为配子体自交不亲和（gametophyitic SI,GSI)和抱子体自交不亲和 (spro地ytic SI，SSI)，目前研究配子体自交不亲和主要集中在花粉自交不亲和决定因子 SFB基因的研究、花柱自交不亲和决定因子S-RNase的研究，研究表明GSI除了花粉决定因 子SFB和花柱决定因子S-RNase外还有其他的与自交不亲和运一性状相关的重要影响因 子，而SSK1 (SLF-interacting SKPl-likel)-个位于S位点外的一类新的SKPl-likel基 因就是其中之一。而对新疆野生扁桃自交不亲和性该基因的深入研究必将大大丰富运方面 的遗传理论并对加强扁桃类植物的遗传理论和将来在育种实践中利用运一宝贵的野生种 质资源意义深远。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于：提供一种新疆野扁桃自交不亲和SSK基因的克隆及双元表达 载体的构建方法，本发明首次从新疆野扁桃中分离出自交不亲和性SSK1基因的全长cDNA。 并完成了其双元表达载体的构建，用Trizol法提取新疆野扁桃花粉的总RNA，测定ODze。/ OD2W比值为2.Oil;将PCR产物进行凝胶回收，回收后的产物与PMD-18T克隆载体进行连 接，转化结束后进行质粒的提取，将提取的质粒进行PCR及酶切验证，获得了 602bp的DNA 条带；测序后发现该基因开放阅读框（OR巧为534bp，编码177个氨基酸的多肤，将该基因 在NCBI上进行Blast比对，发现和菩薇科李属（Primus)的多个物种的SSK1基因的相似度 高达98%，说明该基因可能是SFB-interactingSKPl-likel基因家族中的一员。用限制性 内切酶PstI和BamHI将目的基因和PCAMBIA1303表达载体分别进行双酶切后，将目的基 因定向连接到植物表达载体上，经转化结束后进行质粒的提取，将质粒进行PCR反应及酶 切验证；分别获得了 1236化P的PCAMBIA1303载体和60化P的目的片段；说明双元表达载体 构建成功，命名为pl303-PtSSKl。本发明为进一步对扁桃自交不亲和性基因进行模式植物 的转基因分析研究，对于自交亲和分子辅助育种提供科学依据。
[0006] 本发明所述的一种新疆野扁桃自交不亲和SSK基因的克隆及双元表达载体的构 建方法，按下列步骤进行：
[0007] 新疆野扁桃SSK1基因的克隆：
[000引 a、用TRIzol法提取新疆野扁桃花粉的总RNA，反转录成cDNA后，根据Prime巧.0 设计引物进行RT-PCR反应；
[0009]b、用上游引物SSK1 -FAATCCCTCTCATAATCTCCAC和下游引物SSK1 -R GCTCAGTCCTCATCAACTCC进行PCR扩增，反应体系 50μL为双氧水 37μLDNA1μL lOXBuffer5μレ上下游引物浓度 10ymol/L各lyLdNTP浓度0. 2mmol/L4yLTaqDNA 聚合酶2. 5U/μL1μLPCR扩增程序为溫度94°C，5min预变性；溫度94°C变性30s，溫度 55°C复性30s，溫度72°CImin反应35个循环；溫度72°C延伸lOmin，溫度4°C保存，2%浓 度的凝胶电泳检测；
[0010]RT-PCR产物回收、连接、转化及测序：
[0011] C、根据天根生物公司的胶回收试剂盒进行胶回收，将4μΙ回收的片段与ΙμΙ pMD-18T载体W及5μΙsolutionI混合，反应条件为溫度16°C，时间30min;
[001引大肠杆菌的转化：
[0013]t将10μL的连接产物加入到新解冻的50μL的D册α感受态细胞中，冰浴 30min;然后溫度42°C溫水热激30s，迅速冰水浴90s，加入940μLLB液体培养基激活，溫 度 37°C，180;rpm，60min;
[0014]e、将100μL异丙基-β-D-硫代半乳糖巧和20μLf3-半乳糖巧酶均匀涂到含 50mg/L氨节青霉素的LB固态培养基平板中；
[0015]f、将步骤b中LB液体培养基中菌液5000巧m离屯、5min，弃850μL上清，将剩下的 菌液混匀涂到步骤e中含50mg/L氨节青霉素的LB固态培养基的平板中，先正面向上在溫 度37Γ的培养箱中培养30min，然后倒置过夜；
[0016]g、在无菌环境中从步骤f菌液中挑取白色单菌落接种到5mL含50mg/L氨节青霉 素的LB液体培养基中，220rpm，溫度37 °C培养过夜；
[0017]h、转化结束后进行质粒的提取，质粒提取按Genview质粒提取试剂盒说明进行， 并用EcoI和化ndIII进行双酶切验证，反应体系为EcoI 0.5μLμL化ndIII 0.5μL重 组质粒5μL缓冲液2μL(1地2〇 12μL溫度37°C，反应化；将提取的质粒进行PCR及酶切 验证，获得了 60化P的DNA条带，其中为500mMKClUOOmMS(径甲基）氨基甲烧和15mM MgClz，pH8. 3,其中缓冲液为500mMKClUOOmMS(径甲基）氨基甲烧和15mMMgClz，pH 8. 3 ;
[0018] 双元表达载体pCAMBIA1303-PtSSKl的构建：
[0019]i、将阳性pMD18-PtSSKl质粒和PCAMBIA1303载体质粒分别用PstI和BamHI 进行双酶切，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，利用T4DNA连接酶溫度16°C连接 30min，W连接体系转化E.coliD册α，将转化产物涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体 培养基中，溫度37Γ过夜培养过夜，挑取单菌落在含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中 培养过夜。
[0020] 步骤d中LB液体培养基为不含氨节抗生素的LB液体培养基。
[0021] 本发明所述的新疆野扁桃自交不亲和SSK基因的克隆及双元表达载体的构建方 法，该方法中核巧酸序列：
[0023] 编码氨基酸序列：
[0024]
[00 巧]
[0026] 本发明所述的新疆野扁桃自交不亲和SSK基因的克隆及双元表达载体的构建 方法，将提取的质粒进行PCR及酶切验证，获得了 60化P的DNA条带；经测序后表明：该 基因0RF534bp，编码177个氨基酸的多肤，将该基因在NCBI上进行Blast比对，表明和 李属（Primus)的SSK1基因的相似度高达98 %，说明该基因可能是SFB-interacting SKPl-likel基因家族中的一员。同时进行鉴定：提取质粒，将质粒进行PCR及酶切验证；将 检测结果为阳性的双元表达载体送测序。分别获得了 1236化P的PCAMBIA1303载体与为 602bp的目的片段；说明获得了目的基因的植物双元表达载体，命名为pl303-PtSSKl。
[0027] 本发明的有益效果在于：提供一种新疆野扁桃自交不亲和SSK1基因的克隆及双 元表达载体的构建方法，本发明首次从新疆野扁桃中分离出自交不亲和性SSK1基因的全 长cDNA。并完成了其双元表达载体的构建，为进一步对扁桃自交不亲和性基因进行模式植 物的转基因分