一种海藻酸裂解酶sha-4基因及其原核表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种海藻酸裂解酶SHA-4基因及其原核表达载体PGEX-4T-1-S?-么该载体高效表达海藻酸裂解酶蛋白SHA-4。
【背景技术】
[0002]近年来海洋资源的开发利用已逐渐成为研究的热点，海藻酸因其独特的理化性质在食品、医药和化工等领域具有广泛的应用前景。海藻酸寡糖因具有多种生理活性，成为开发新药的聚焦点。同时海藻酸作为最丰富的海洋生物质之一，因具有以下优势:(1)光合作用效率高，生长快，产量高，资源丰富；(2)生长不占用耕地；(3)几乎不含有木质素，纤维素的含量很少，预处理简单，便于微生物的利用和发酵；从而在生物能源领域受到了广泛的关注。目前，降解海藻酸的方法可分为三大类:第一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸。第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一的酶制剂或使用不同底物专一性组合的酶制剂。
[0003]海藻酸裂解酶主要由海藻酸分解菌和一些海洋动植物等产生，具有很大的应用前景。但野生型海藻酸分解菌产酶量低且成本高，很难达到实际的应用要求。因此，通过基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。1993年，Boyd等首次克隆了 Pseudomoms akiflorara海藻酸裂解酶的编码基因algL并在大肠杆菌中进行了表达，其粗酶液活性达到146U/mg。1996年Frederic等将PseudomormsaJgiflorara中编码海藻酸裂解酶的基因aly在大肠杆菌中表达，其催化活性达到97U/mg。2009 年，GaofeiPseudoalteromonas sp.CY24 中克隆得到了海藻酸裂解酶基因alyPI，并在大肠杆菌中进行表达，得到一个催化活性为121.6U/mg，分子量为58KD的蛋白。2012年，Hwan Hee Park等利用泣化柳遍mss sp.MJ-3的基因组构建基因文库，筛选得到了一段海藻酸裂解酶的基因，并将其在大肠杆菌中表达，得到了一种对polyM和polyG都有活性的双功能酶。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种海藻酸裂解酶SHA-4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本海藻酸裂解酶SHA-4基因来源于ifariflicaiefla alginatilytica SH-52 (保藏编号为CCTCC NO:M2013073，该保藏菌株在本申请申请日之前已经在其他专利申请文件中公开过)，由本实验室全基因组测序获得，通过BLAST比对，结果显示与菌株ZMeWiagalactanivorans DsiJT的海藻酸裂解酶的相似度为64%。
[0005]本发明另一目的是提供一种海藻酸裂解酶SHA-4基因的原核表达载体，该载体含有Ptac启动子、终止子和海藻酸裂解酶基因细菌核糖体结合位点RBS、GST标签，兄癌因的上游为Ptac启动子，Ptac启动子的下游为可被IPTG诱导的操纵子序列，紧靠兄^-癌因起始密码子上游的是一个GST标签序列，可生成融合表达蛋白，之后通过凝血酶可将GST标签切除而不影响目的蛋白的结构活性。
[0006]本发明的另一个目的是将algina tilytica SH-52海藻酸裂解酶SHA-4基因的原核表达载体应用在制备海藻酸裂解酶SHA-4中。
[0007]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案:
1、teas algina tilytica SH-52海藻酸裂解酶基因5??的获得和原核表达载体的构建
(1)根据Marinicatenaalgina tilytica SH-52海藻酸裂解酶因编码框序列和原核表达载体PGEX-4T-1多克隆位点，设计1对特异引物如下:
SHA-4-F:5’ - GGATCCATGAAAAGCGCAATCAACTATCTCA-3’
SHA-4-R: 5 ’ -GCGGCCGCTTATTGATTAACATGTGTCAAATTTTCG-3，，在上下游引物的 5 ’ 端分别加入BamH I和Not I酶切位点(下划线为酶切位点)；提取ifariflicaiefla algina tilyticaSH-52的基因组，使用上述引物进行扩增；
(2)回收并纯化海藻酸裂解酶全长基因片段，并将其连接到PMD19-T载体上，采用SDS-碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD19T-S?-名
(3)构建原核表达载体pGEX-4T-l-S?-么用BamHI和Not I双酶切pMD19T_S?-存口PGEX-4T-1，并回收纯化海藻酸裂解酶癌因片段及pGEX-4T-l载体片段，然后连接、转化、抽提质粒进行双酶切验证，获得原核表达载体PGEX-4T-1-S?-么进行测序后，将测序结果进行生物信息学分析。
[0008]2、海藻酸裂解酶SHA-4的原核表达
使用热刺激法将PGEX-4T-1-S?-祷专入大肠杆菌BL21 (DE3)中，通过IPTG诱导筛选最佳表达条件，并在最适条件下进行大量表达；
3、海藻酸裂解酶SHA-4的蛋白纯化
收集菌体，进行超声破碎，得到的上清通过GST琼脂糖凝胶柱进行纯化，收集纯化后的蛋白用于SHA-4的蛋白表达检测及下一阶段实验；
4、重组海藻酸裂解酶SHA-4的特性研究
对纯化后的海藻酸裂解酶SHA-4进行以下特性研究:最适温度，最适pH等，本发明获得的重组海藻酸裂解酶SHA-4，其最适温度为37°C，最适pH为7.5 ;本发明中采用的测定方法为常规海藻酸裂解酶酶活性测定方法，测定反应底物在Α235ηηι处吸光值的变化。
[0009]本发明对新型的来自于厌氧海藻酸分解菌algina tilytica SH-52中海藻酸裂解酶基因5^-4?行了扩增，并进一步进行原核表达和蛋白纯化，获得了 SHA-4蛋白。现有技术海藻酸裂解酶的野生菌株通过发酵培养到产酶，至少需要3天的时间，而本发明的基因工程菌株只需6h即可获得最大量的目的蛋白，本发明所获得的重组海藻酸裂解酶SHA-4蛋白具有广泛的底物特异性，除可以利用海藻酸外还可以利用PolyM和PolyG，酶活可以达到21U/mg，是一种具有广阔应用前景的功能酶，本发明原核表达载体及整体表达系统容易操作，便于工业化生产；本发明解决了现有的产海藻酸裂解酶菌株酶产量较低的问题，也为进一步对海藻酸裂解酶SHA-4进行机理及机制研究奠定了基础。
【附图说明】
[0010]图1是本发明Marinicatena algina tilytica SH-52基因组DNA的检测不意图，图中:Μ是DNA marker ; 1和2是基因组DNA ；
图2是本发明海藻酸裂解酶SHA-4基因的TA克隆策略示意图；
图3是本发明重组质粒pMD19T-S?-4的电泳检测示意图，图中:M是DNA marker ;1、2是 pMD19T-S?-名
图4是本发明重组质粒PMD19T-兄K的双酶切检测示意图，图中:Μ是DNA marker ；1-3是BamH I与Not I双酶切的pMD19T_S?-顺粒；
图5是本发明重组质粒pMD19 ?-SHA-M PCR检验示意图，图中:Μ是DNA marker ；1是负对照；2是以pMD19T-兄K为模板，用SHA-4-F，SHA-4-R为引物扩增的PCR产物；
图6是本发明海藻酸裂解酶癌因的原核表达载体构建示意图；
图7是本发明重组质粒pGEX-4T-l-S?-4的电泳检测示意图，图中:M是DNA marker ；
1、2 是 pGEX-4T-l-S?-名
图8是本发明重组质粒pGEX-4T-l-S?-4的酶切检测示意图，图中:M是DNA marker ；
1是BamH I与Not I双酶切的的pGEX-4T-l-S?-4质粒；
图9是本发明海藻酸裂解酶SHA-4表达的SDS-PAGE检测示意图，图中:Μ是蛋白marker ；1是pGEX_4T_l质粒在37 °C，未经IPTG诱导后，10h的细菌总蛋白；2是pGEX-4T-l-兄K质粒在37 °C，未经IPTG诱导后，10h的细菌总蛋白；3_8是pGEX-4T-l-S?-4质粒在 37°C，经 ImM IPTG 诱导后，0、2、4、6、8、10h 的细菌总蛋白；
图10是本发明海藻酸裂解酶SHA-4在37°C下表达情况，图中:M是蛋白marker ;1是pGEX-4T-l-S?-4质粒在 37°C未经 IPTG 诱导，6h 的细菌总蛋白；2_7 是 pGEX_4T_l- SHA-4质粒在37°C、经终浓度分别为0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mMIPTG诱导6h的细菌总蛋白；
图11是本发明海藻酸裂解酶SHA-4在不同温度诱导下的表达情况，图中:M是蛋白marker ； 1是pGEX-4T-l-S?-4质粒在37 °C未经IPTG诱导，12h的细菌总蛋白；2_6是pGEX-4T-l-S?-4质粒分别在15、20、25、28、30°C经终浓度为0.1mM IPTG诱导6h的细菌总蛋白；
图12是本发明海藻酸裂解酶的纯化电泳示意图，图中:M是蛋白marker ;1是纯化前的细菌上清蛋白；2是纯化后的流川液；3是纯化后的洗涤液；4是用还原性谷胱甘肽洗脱后的洗脱液；
图13是本发明海藻酸裂解酶SHA-4的最适pH示意图，图中:菱形曲线为SHA-4蛋白在pH6.0-8.0磷酸盐缓冲液中的活性示意图；正方形曲线为SHA-4蛋白在pH8.0-9.0Tris-HCl缓冲液中的活性示意图；
图14是本发明海藻酸裂解酶SHA-4的最适温度示意图；
图15是本发明海藻酸裂解酶SHA-4的金属离子影响示意图；
图16是本发明海藻酸裂解酶SHA-4的底物特异性示意图。
【具体实施方式】
[0011]下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0012]本实施例中试剂主要分为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、pfu DNA聚合酶、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)及北京庄盟国际生物基因科技有限公司产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器；所有引物序列均在上海生工合成。
[0013]实施例\..Marinicatena algina tilytica SH-52 基因组 DNA 的制备与检测本发明所用的Marinica tena algina tilytica SH-52为本实验室筛选菌株，SH-52基因组DNA的制备采用普通细菌基因组提取方法，具体内容如下:取2mL过夜培养菌液于4°C，4000rpm离心2min，弃尽上清液，收集菌体；加入lOOul Solut1n I悬菌、30 μ 1 10%SDS和1 μ 1 20mg/ml蛋白酶K，混匀，37°C孵育1小时；加入100 μ 1 15mol/L NaCl，混匀；加入20 μ 1 CTAB/NaCl 溶液(CTAB 10%, NaCl 0.7mol/L)，混匀，65°C，10 分钟；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，12000rpm离心5分钟；取上清，加入2倍体积无水乙醇，0.1倍体积3mol/L NaOAC，_20°C放置30分钟；12000rpm离心10分钟；沉淀加入70%乙醇洗涤；沉淀干燥后，溶于20 μ 1 TE，-20°C保存。取2 μ 1基因组DNA用1%的琼