一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类化合物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，尤其涉及一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]肝癌细胞(hepatocellular carcinoma, HCC,以下简称肝癌)是一种恶性程度高、预后凶险的肿瘤，5年生存率只有7%左右，是全球第五位最常见的恶性肿瘤，在全世界肿瘤患者的致死率中高居第三位。我国肝癌发病人数约占全球的半数以上，发病年龄趋于年轻化。目前我国肝癌年死亡率为20/10万左右，位居我国各种恶性肿瘤死亡率的第2位，并且近10年来一直呈上升趋势。肝癌已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容忽视。
[0003]研究表明，一些中药复方或单味药的有效成分能诱导肿瘤细胞凋亡，其抗癌疗效与中药诱导肿瘤细胞凋亡有关。黄绿蜜环菌子实体是生长于青藏高原的珍稀野生食药用菌。目前有限的研究表明，黄绿蜜环菌子实体中含有较丰富的蛋白质、氨基酸、糖类、生物碱和少量有机酸、黄酮、强心苷、留体三萜类、苷类、皂苷、挥发油、香豆素萜类、鞣质、酚类化合物等，该类化合物具有抗流感、防治神经炎、脚气病、促进儿童发育、抗氧化及抗肿瘤等生物活性。
[0004]中国专利申请CN 103494843A《黄蘑菇标准化组分制法及其在肺癌治疗中的应用》和CN 103494843A涉及了黄绿蜜环菌子实体标准化组分的制备方法及其在肺癌和肝癌中的应用，并未明确组分中的具体化学成分。文献中对黄绿蜜环菌子实体化学成分的研究同样极度匮乏。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易于实施的一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类组分的制备方法。
[0006]本发明所要解决的另一个技术问题是提供该黄绿蜜环菌留醇类活性化合物在肝癌治疗中的应用。
[0007]为解决上述问题，本发明所述的一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法，包括以下步骤:
[0008]⑴黄绿蜜环菌丙酮提取物加入其体积的I?6倍10%?50%正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以10 μ m硅胶为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、FrlO、Frl2、、Frl3、Frl4 共 14 个标准化组分样品；
[0009]⑵将所述14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选:
[0010]①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5% 0)2培养箱工作正常；
[0011]②8孔细胞板内按150 μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基；
[0012]③将所述14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液；
[0013]④将对数生长期的人肝癌细胞H印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X 14个/mL，得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞ifepG2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30min ;
[0014]⑤将所述14个标准化组分样品分两批按每孔加5 μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肝癌细胞H印G2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45h后得到两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应；
[0015]⑥根据所述两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0016]⑶将第8号标准化组分加入其体积的2?5倍5 %?20 %正己烷-乙醇混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含第8号标准化组分的样品溶液；所述含第8号标准化组分的样品溶液在以10 μπι XAmide为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得 Fr8-1、Fr8-2、Fr8_3、Fr8-4 共 4 个样品；
[0017]⑷将所述4个样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选:
[0018]①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5% 0)2培养箱工作正常；
[0019]②8孔细胞板内按150 μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基；
[0020]③将所述4个样品中的每个样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液；
[0021]④将对数生长期的人肝癌细胞H印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X 14个/mL，得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞ifepG2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30min ;
[0022]⑤将所述4个样品分两批按每孔加5 μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肝癌细胞H印G2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45h后得到两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应；
[0023]⑥根据所述两张黄绿蜜环菌子肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第FrS-1号样品和第Fr8-4号样品具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0024]所述步骤⑴和所述步骤⑶中减压浓缩的条件是指真空度为0.06?0.09MPa，温度为 50 ?70°C。
[0025]所述步骤⑴中制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260 X 50mm ;采用A为正己烧、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0?15min，100% A?100% A ;15?35min，60% A?60% A ;35?50min，0% A?0% A ;检测波长为260nm ;上样量为1.0g。
[0026]所述步骤⑶制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为250 X 20mm ;采用A为正己烷、B为乙醇的二元流动相体系进行分离:0?40min，97% A?92% A ;检测波长为260nm ;上样量为0.15或0.3go
[0027]如上所述的黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法所得的活性样品其特征在于肝癌治疗中的应用。
[0028]如上所述的黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法所得的活性样品其特征在于:该活性样品作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
[0029]本发明与现有技术相比具有以下优点:
[0030]1、本发明采用制备色谱两步纯化，从黄绿蜜环菌子实体中分离得到了具有抗肝癌活性的样品(参见图1、图3)，不但工艺简单，而且易于实施。
[0031]2、本发明利用iCELLigence系统检测，可实时动态检测细胞贴壁和增殖过程，提供高信息量的细胞效应图谱，提供大量、重要的动态反应信息；无标记、无创伤的电子检测不会干扰细胞生长和分析；可高准确/精确度的定量衡量细胞生长，提供高于2个数量级的动态范围；整个实验过程自动收集数据，实时分析，大大改善仅仅在最终点分析的结果；在培养孔中检测细胞质量，达到了活细胞品质控制的目的(参见图2、图4)。
[0032]3、本发明以细胞生长曲线为基本指标判定标准化组分和样品对贴壁、繁殖等细胞生理活性的影响，结果直观、易判断；所得的留醇类活性样品可用于研发制备抗肝癌治疗药物。
[0033]4、本发明拓展了抗肝癌药物的原料来源，扩大了黄绿蜜环菌子实