Csf2基因及其表达产物的新用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及肿瘤标志物，具体设及CSF2基因及其表达产物的新用途，更具体的设 及CSF2基因及其表达产物在诊治烦内动脉瘤中的应用。
【背景技术】 W〇2] 烦内动脉瘤（intracranialaneirrysm，ΙΑ)是动脉管壁病理性局限性扩张 产生的脑血管瘤样突起，其破裂是引起人类自发性蛛网膜下腔出血的首位原因（约占 79% -89% )，占烦内出血的25%，其病死率及致残率极高，严重影响着人们的健康和生命。 随着影像技术的发展和人们健康认识水平的提高，未破裂动脉瘤的发现率也有所增加，烦 内动脉瘤己经是常见和多发的脑血管病之一。通过百余年的研究与实践，对烦内动脉瘤的 发生、生长、塑形、破裂的确切机制仍不明了。通常认为ΙΑ的形成、发展和破裂是由遗传、吸 烟、年龄、环境、动脉粥样硬化、高血压和高血脂W及血流动力学改变等多重因素造成的。随 着对其研究的不断深入，人们己经逐渐认识到ΙΑ通常多发生在Willis动脉环W及烦内动 脉血管分叉处或血管弯曲部位，血液流经此处时形成冲击流等复杂流型使血管内皮细胞及 其连接受损，炎症细胞和炎性物质等更易进入内皮下，引起的血管壁炎症和血管壁重构失 调，研究显示持续的血流动力学变化会导致血管的病理重构，包括内弹力层的降解、平滑肌 细胞和内皮细胞的缺失、细胞增殖减少等。IA的形成可能是烦内相关动脉内皮组织损伤与 修复失衡的结果，但具体哪些基因参与其中仍有待研究掲示。
[0003] 发明人基于高通量测序对5例烦内动脉瘤壁组织和3例进行分析，在差异表达基 因中挑选出显著高表达的候选基因CSF2,现有研究表明CSF2调控粒细胞和巨隧细胞的增 殖和分化，但并没有研究掲示其与烦内动脉瘤的关系，发明人进行了RT-PCR验证和细胞验 证，证实了CSF2在烦内动脉瘤组中高表达，干扰CSF2基因的表达会影响EPCs的活性。本 发明提供了一种烦内动脉瘤的诊治祀点，具有重要的临床应用价值。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种烦内动脉瘤诊断制剂，所述烦内动脉瘤诊断制剂检测 CSF2基因和/或CSF2基因表达产物的表达量。 阳0化]进一步，所述烦内动脉瘤诊断制剂采用巧光定量PCR试剂盒、基因忍片、免疫方法 检测烦内动脉瘤组织中CSF2基因的表达，优选的，所述的巧光定量PCR试剂盒中含有一对 特异性扩增CSF2基因的引物；所述的基因忍片中包括与CSF2基因的核酸序列杂交的探针， 更优选的，巧光定量PCR试剂盒内含有特异性检测CSF2基因的上游引物和下游引物，上游 引物序列为SEQIDNO. 10,下游引物序列为SEQIDNO. 11。
[0006] 进一步，检测外周血和/或组织中CSF2基因和/或基因的表达产物。
[0007] 进一步，所述的烦内动脉瘤的诊断制剂采用免疫方法检测烦内动脉瘤外周血和/ 或组织中CSF2基因的表达产物，优选的，所述免疫方法为化ISA检测和/或胶体金检测。
[0008] 进一步，所述检测CSF2表达产物的化ISA法为使用化ISA检测试剂盒。所述试剂 盒中的抗体可采用市售的CSF2单克隆抗体。进一步，所述的试剂盒包括：包被CSF2单克隆 抗体的固相载体，酶标抗体，酶的底物，蛋白标准品，阴性对照品，稀释液，洗涂液，酶反应终 止液等。
[0009] 进一步，所述检测CSF2蛋白的胶体金法为使用检测试剂盒，所述的抗体可采用市 售的CSF2单克隆抗体。进一步，所述的胶体金检测试剂盒采用胶体金免疫层析技术或胶体 金渗滤法。进一步，所述的胶体金检测试剂盒硝酸纤维素膜上的检测区灯）喷点有抗CSF2 单克隆抗体、质控区（C)喷点有免疫球蛋白IgG。
[0010] 本发明的目的在于提供上述烦内动脉瘤诊断制剂在制备烦内动脉瘤诊断工具中 的应用。
[0011] 本发明的目的在于提供一种治疗烦内动脉瘤的制剂，所述制剂中含有抑制CSF2 基因的转录或表达的试剂或化合物。优选的，制剂中含有药剂学可接受的载体。
[0012] 进一步，所述治疗烦内动脉瘤的制剂中含有激活CSF2的抑制基因、激活抑制CSF2 表达的蛋白、导入抑制CSF2转录或表达的siRNA、激活促进CSF2mRNA降解的microRNA、导 入促进CSF2蛋白降解的分子、抑制促进CSF2表达的因子及蛋白的表达。
[0013] 优选的，所述治疗烦内动脉瘤的制剂含有抑制CSF2基因的转录或表达的siRNA。 优选的，针对CSF2基因的SEQIDNO. 1和/或SEQIDNO. 4和/或SEQIDNO. 7位点设计 siRNA。更优选的，抑制CSF2基因的转录或表达的siRNA选自下列中的一组或几组siRNA: 沈QIDNO. 2 和沈QIDNO. 3、SEQIDNO. 5 和沈QIDNO. 6、SEQIDNO. 8 和沈QIDNO. 9。 更优选的，所述治疗烦内动脉瘤的制剂含有SiRNA序列为SEQIDNO. 8和SEQIDNO. 9。
[0014] 本发明的目的在于提供上述治疗烦内动脉瘤的制剂在制备烦内动脉瘤治疗药物 或试剂中的应用。
[0015] 本发明的目的在于提供上述治疗烦内动脉瘤的制剂在制备增强EPCs活性制剂中 的应用。
[0016] 为实现上述目的，本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因CSF2基因，进而通过分子细胞生物学方法验证了CSF2基因与烦内动脉瘤的关系：CSF2 基因在烦内动脉瘤组织中高表达，与烦内动脉瘤具有很好的相关性，可用于制备烦内动脉 瘤辅助诊断制剂，具有重要的临床应用价值。
[0017] 本领域人员熟知抑制基因及其表达产物的表达通常可W采用下述方法中的一种 和/或几种：通过激活目的基因的抑制基因、激活目的基因的抑制基因表达的蛋白、采用 RNA干扰技术抑制目的基因表达、激活促进目的基因mRNA降解的microRNA、导入促进目的 基因编码蛋白降解的分子、抑制促进目的基因表达的因子及蛋白的表达。 阳01引 RNA干扰（RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源祀基因的 mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断 体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。SiRNA 设计完成后可W采用直接合成法或者构建SiRNA表达载体，制备好的SiRNA可W通过憐酸 巧共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子 脂质体试剂法等途径转染细胞。
[0019] 巧光定量PCR法是通过巧光染料或巧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可W对产物进行分析，计算待测样品模板 的初始浓度。巧光定量PCR的出现，极大地简化了定量检测的过程，而且真正实现了绝对定 量。多种检测系统的出现，使实验的选择性更强。自动化操作提高了工作效率，反应快速、 重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰。
[0020] 基因忍片又称为DNA微阵列值NAmicroarray)，可分为Ξ种主要类型：1)固定在 聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记 的祀基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针 阵列，通过与巧光标记的祀基因杂交进行检测。3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核巧 酸探针阵列，与巧光标记的祀基因杂交进行检测。基因忍片作为一种先进的、大规模、高通 量检测技术，应用于疾病的诊断，其优点有W下几个方面：一是高度的灵敏性和准确性；二 是快速简便；Ξ是可同时检测多种疾病。
[0021] 本发明的目的在于提供一种检测烦内动脉瘤的基因检测试剂盒，所述试剂盒检测 基因CSF2,采用特异的上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQIDNO. 10,下游引物序列 为沈QIDNO. 11。
[0022] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型巧光定量基因扩增仪， 灵敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0023] 进一步，上述巧光定量PCR试剂盒组分包括：特异性引物、内参引物、巧光定量PCR 反应液。所述内参为GAPDH。
[0024] 所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。
[00巧]本发明目的是提供了一种烦内动脉瘤蛋白检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测CSF2蛋白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[00%] 本发明目的是提供了一种检测烦内动脉瘤的基因忍片，所述的基因忍片包括与 CSF2基因的核酸序列杂交的探针。
[0027] 本发明的药剂学上可接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖 (lactose)、右旋糖（dextrose)、薦糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘露醇（mannitol)、 淀粉、阿拉伯橡胶、憐酸巧、藻酸盐（alginate)、凝胶（gelatin)、娃酸巧、微晶纤维素、聚乙 締化咯烧酬（P〇lyvin}dpy;r;rolidone)、纤维素（cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素（methyl cellulose)、径基苯甲酸甲醋（methylhy化oxybenzoate)、丙基径基苯甲酸丙醋（propyl hy化oxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearicacidma即esium)及矿物油（mineraloil) 等，但并非局限于此。
[0028] 本发明的药剂学可接受的载体除了上述成分W外还可W包含润滑剂、湿润剂、甜 味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上许可的适合的载体和制剂详细记载于雷 明登氏药学全书。
[0029] 本发明的药剂学组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通 过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮 给药等方式进行给药。
[0030] 本发明的药剂学组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年 龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可W 进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给 药剂量。
[0031] 本发明的药剂学组合物根据本