Charcot-Marie-Tooth病的治疗剂的筛选方法以及为此所使用的自分化运动神经元的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及制备诱导多能干细胞的方法W及使用由所述诱导多能干细胞分化而 来的自体细胞筛选化arcot-Marie-Tooth病的治疗剂的方法。
【背景技术】
[0002] Qiarcot-Marie-Tooth病（CMT)或遗传性运动感觉神经病变化ereditarymotor andsenscxryneuropathy)是由特定基因突变引起的运动神经元和感觉神经元的缺陷或损 坏。遗传性周围神经病变可分为Ξ组，即，遗传性运动感觉神经病变（HMSN)、遗传性运动神 经病变（HMN)和遗传性感觉神经病变化SN)。因此，遗传性运动感觉神经病变是其中之一。 由于该病是在1886年由化a;rcot、Ma;rie和Tooth首次发现的，所W将该病用他们的名字命 名（即，化arcot-Marie-Tooth病），或者用他们名字的首字母简单地称为CMT。在20世纪 后期，Dyck等将CMT叫做另一个名字遗传性运动感觉神经病变0MSN)"，此后该病如今被 叫做CMT或歷SN。根据遗传模式，化arcot-Marie-Tooth病被分为许多组，即常染色体显性 遗传的I型和II型、常染色体隐性遗传的IV型和X染色体连锁遗传的CMTX型。根据基因 突变的报道顺序，将I型成员命名为1A、1B、1C等。
[0003] 化arcot-Marie-Tooth病的发病率是1/2500,运在罕见遗传性疾病中相当高。 化arcot-Marie-Tooth病患者表现出此类症状：他们手/脚的肌肉变得越来越无力，而且他 们的手和脚经常是变形的。症状的程度根据基因突变的类型而改变。一些患者表现为几乎 接近正常人的轻度症状，一些患者显示出严重症状，W致于他们需要行走方面的帮助或者 要坐轮椅。
[0004]CMT的传统治疗方法限于康复、辅助技术设备和疼痛控制。但是，CMT相关基因的 鉴定使得遗传咨询和家庭计划成为可能，在此基础上，W科学为基础的临床护理正在推进 中。尚未建立可改变遗传性运动感觉神经病变的进展过程的实际治疗或帮助，但最近的动 物测试确证了运一可能性。同时，仍在进行关于如下的研究：基因疗法、细胞替代疗法、轴突 运输相关疗法、线粒体功能矫正、基于免疫系统的疗法和整合素疗法。
[0005] 随着过去几十年在罕见疾病研究中的惊人进步，在该疾病的治疗（从诊断到治 疗，包括实践指南）方面取得了量和质的变化。特别是，分子生物学的进步使得诊断方法发 生变化，并因此建立了由个体化代表的祀向疗法或考虑到罕见疾病的不同分子生物学起源 的定制疗法（tailoredtherapy)。另外，遗传药理学的发展提供了如下构想：考虑患者自 身的遗传特征，可区别对待甚至具有相同疾病或服用相同药物的患者。因此，我们可将现在 称为"分子遗传学的时代"。特别是，就各种治疗选择和预后（包括旨在用药物疗法和额外 治疗减轻症状的症状性治疗，W及旨在减轻和控制副作用与并发症的支持性疗法）而言， 在罕见疾病中CMT是公开最多的。CMT由基因功能障碍引起，所W症状是持续的并且不能完 全治愈。因此，CMT的常规治疗在于减轻症状和延迟进展，W提高生活质量。已通过遗传和 分子生物学研究不断地尝试生物学治疗，并报道了一些有前途的结果。然而，该疾病的特征 导致发病罕见，并且推进该研究的兴趣也低，因此合适的治疗方法尚未建立，并且，能够诊 断并设计用于此类罕见疾病的治疗的医生和研究人员仍短缺（ActaPaediat;ri，2012)。
[0006] 根据W前的报道，在给予孕酬受体括抗剂"奥那司酬（onapristone)"(已知的一 种CMT治疗药物）的转基因小鼠中，Pmp22mRNA的过表达被抑制，遗传性运动感觉神经病 变的表型得到改善，也没有副作用。抗坏血酸（对外周神经的髓銷形成（myelination)而 言至关重要的物质）在髓銷再生（remyelination)中起作用，并改善了CMT1A转基因小鼠 中遗传性运动感觉神经病变的表型。还报道了神经营养蛋白-3 (NT-3)使有髓神经纤维增 加，由此使感觉相关的症状得到改善。然而，上述治疗物质限于1型CMT治疗。CMT由几十 种不同的基因突变引起。因此，为了治疗具有多样性的此类CMT，迫切需要建立各基因缺陷 的定制治疗方法W及评估新建立的治疗方法的方法。在CMT患者中，对药物的应答大大不 同，因此药物选择由于CMT患者的症状均不同而受到限制。
[0007] 获得自患者皮肤组织的干细胞具有该患者的基因突变的特征。因此，当所述干细 胞分化为神经元时，可获得具有该患者所有疾病特征的神经元，预计运对药物选择或患者 特异性治疗有用。
[0008] 化arcot-Marie-Tooth病（CMT)(代表性遗传性周围神经病变）是单基因素乱。可 通过源自患者皮肤细胞的诱导多能干细胞的分化来构建CMT疾病模型。可通过使用能够重 现该疾病特征的此类疾病模型来制备新的治疗剂。将源自患有脊髓性肌萎缩、家族性自主 神经机能异常（dysautonomia)或LEOPARD综合征的患者的诱导多能干细胞用于在体外重 现运些患者的异常和症状。当用测试药物处理培养的细胞时，症状得到改善巧bedAD.等， Nature,2009,457 :277-280;LeeG.等，Nature,2009,461:402-406 ;Cavajal-Vergara X.等，化 1:ure，2010,465 :808-812 ;化nnaJ.等，Science, 2007, 318:1920-1923)。因此，诱 导多能干细胞和由该诱导多能干细胞分化而来的自体细胞可用于该途径，W给患有没有合 适的治愈手段（cure)的运些疾病的患者开发出患者特异性的新药物，运表明它们可对患 有不可治愈的罕见疾病的患者有帮助。
[0009] 在建立用于化arcot-Marie-Tooth病（CMT)患者的患者特异性治疗方法的研究过 程中，本发明人首次从源自CMT患者的人成纤维细胞制备出诱导多能干细胞。然后，本发明 人进一步确认了，使用由所述诱导多能干细胞分化而来的运动神经元进行的CMT治疗剂候 选物的筛选方法可对该候选物的药学效果的确认有用；并且，本发明人进一步通过本发明 的方法构建出自体运动神经元，该自体运动神经元可用于患者特异性药物的筛选，并因此 可用于患者特异性治疗，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0010] 技术问题
[0011] 本发明的一个目的是提供用于从体细胞制备运动神经元的方法，所述体细胞来源 于Qiarcot-Marie-Tooth病（CMT)患者。
[0012] 本发明的另一目的是提供CMT治疗剂候选物的筛选方法。
[0013] 本发明的再一目的是提供由通过本发明的方法制备得到的诱导多能干细胞分化 而来的CMT患者自体运动神经元。
[0014] 本发明的又一目的是提供使用通过本发明的方法制备得到的CMT患者自体运 动神经元进行的患者特异性CMT类型依赖性治疗剂（CMTtype(kpendenttherapeutic agent)的筛选方法。
[001引技术方案
[0016] 为了实现上述目的，本发明提供了用于从体细胞制备运动神经元的方法，所述体 细胞来源于Oiarcot-Marie-Tooth病（CMT)患者。
[0017] 本发明还提供了CMT治疗剂候选物的筛选方法。
[0018] 本发明进一步提供了由通过本发明的方法制备得到的诱导多能干细胞分化而来 的CMT患者自体运动神经元。
[0019] 另外，本发明提供了使用通过本发明的方法制备得到的CMT患者自体运动神经元 进行的患者特异性CMT类型依赖性治疗剂的筛选方法。
[0020] 有益效果
[0021] 本发明提供了用于从人成纤维细胞制备诱导多能干细胞的方法，所述人成纤维细 胞来源于化arcot-Marie-Tooth病（CMT)患者；通过使用由所述诱导多能干细胞分化而来 的运动神经元进行的CMT治疗剂候选物的筛选方法，该方法可有效确认运些候选物的药学 效果；W及通过用于制备诱导多能干细胞的方法制备的CMT患者自体运动神经元。可将所 述自体运动神经元有效用于患者特异性药物的筛选W及患者特异性治疗。
【附图说明】
[0022] 参考附图来更好地理解本发明的优选实施方式的应用，其中：
[0023] 图1为说明本发明中使用的人成纤维细胞的形状的图。
[0024] 图2为说明从源自CMT的诱导多能干细胞（iPSC)分化出运动神经元的方法的图。
[00幼 图3为说明源自CMT的诱导多能干细胞（CMT2F-iPSC)中服P27 (致CMT基因） 的基因突变的图。
[0026] 图4为说明CMT2F-iPSC集落的形状的图。从培养开始起20天拍摄运张照片，细 胞密集聚集在诱导多能干细胞集落中。
[0027] 图5为说明CMT2F-iPSC内源多能性基因的表达的图。
[0028] 图6为说明CMT2F-iPSC干性（ste皿ess)标志物蛋白的表达的图。
[0029]图7为说明由CMT2F-iPSC诱导而来的胚状体巧B)的体外分化潜能的图，其中， 确认了外胚层标志物巢蛋白、中胚层标志物平滑肌肌动蛋白（SMA)和内胚层标志物甲胎蛋 白（AFP)的表达。
[0030] 图8为说明通过观测体内CMT2F-iPSC崎胎瘤形成所确证的分化潜能的图。
[0031] 图9为说明由CMT2F患者分化而来的CMT2F-MN的标志物蛋白的表达W及神经 肌肉接头（neuromus州larjunction)形成的一组图；
[0032] 图9a为说明CMT2F-MN标志物蛋白化B9、I化1、SMI32、Tujl、MAP2突触蛋白和 ChA