共价闭合的非编码免疫调节性dna构建体的制作方法
【专利说明】
[0001] 说巧书
技术领域
[0002] 本发明设及共价闭合的DNA构建体、药物组合物和疫苗W及它们调节免疫系统的 用途。
【背景技术】
[0003] 术语"免疫疗法"是指通过诱导、增强或抑制免疫反应治疗疾病。免疫疗法的策略 是抵抗疾病，如癌症、传染病、过敏和哮喘。
[0004] 已知多种能被用于免疫疗法的，称作免疫调节剂的活性剂。特定的DNA序列属于 那些已知的免疫调节剂。Krieg等已经描述了大多数已知的免疫调节性短DNA序列含有未 甲基化的胞喀晚鸟嚷岭基序（CG基序）（化化re1995 374 :6522546-549)。与原核生物和病 毒相比，在真核生物基因组中，未甲基化CG基序的产生基本上是被抑制的。因此，含有运样 的基序的DNA分子已经演化为一种天然的"危险信号"并且触发免疫系统对抗原核生物和 病毒的病原体。可W通过使用运样的序列通过免疫疗法治疗或预防感染进行治疗和预防。 阳0化]包含未甲基化CG基序的DNA构建体能够通过强烈地刺激天然免疫系统的效应细 胞引起相当的生理效应，所述效应细胞包括树状细胞、巨隧细胞、天然杀伤细胞（NK)和NKT 细胞。未甲基化的CG基序通过天然免疫模式识别受体Toll样受体（TLR)9检测。虽然确 切的识别机制尚未完全明了，但在掲示底层通路上已经取得显著进展（A.Krieg,化t.Rev. DrugDisc.，5 :471-484,2006)。
[0006] 据推测含有未甲基化CG的DNA构建体结合至受体，在响应细胞中激发多个信号级 联。通过特征性表面分子的上调和细胞因子的分泌，诱导具有主导的Thl模式的适应性免 疫。运样的构建体可W与例如抗体、化疗或放疗、疫苗或细胞因子组合使用。过敏性疾病和 哮喘主要是化2介导的。通过增加化1/化2的比值，化2介导的应答被削弱，从而运些类型 的疾病可W被治疗或预防。
[0007] 通过化R-9通路上调的表面分子包括（依照细胞类型）例如CD40、CD69、CD80、 CD86或CD169。增强的细胞因子的分泌同样是不同的细胞类型的特征；细胞因子包括例 如巨隧细胞炎性蛋白（ΜΙΡ)-Ια、MIP-10、白细胞介素（IU-6、比-8、干扰素（IFN)-a、月中 瘤坏死因子灯NF)-a、IFN-丫、单核细胞趋化蛋白（MCP)-l或lOkDa的IFN-丫-诱导蛋白 (IP-10)。
[0008] 为了预防或治疗疾病，接种疫苗已被证明是一种非常有效的方法。为了确保强大 并持久的免疫应答，能够刺激抗原递呈细胞，例如树状细胞，的佐剂通常与抗原一起给药， 并且为了该目的，TLR9激动剂已经显示出是有效的免疫刺激剂。
[0009] 临床前和后续的临床研究支持化R-9激动剂作为免疫调节剂和/或佐剂的用途， 并且证明了他们通过增强体液和细胞应答的抗肿瘤效果。
[0010] 不依赖任何潜在机制的解释通过未甲基化CG基序影响或调节免疫应答，开发了 许多通过使用运样的基序用于调节免疫系统的方法。wo1998/018810公开了当含有未甲 基化的CG基序的免疫刺激序列是单链的一部分时更加有效。然而，由于单链核酸的快速降 解，给予开链的单链DNA分子是不可行的。因此，发展出了保护包含未甲基化CG基序的单 链或双链DNA构建体的不同方法。
[0011] 为了实现对DNA核酸酶引起的降解的抵抗，核酸多聚体骨架中的憐酸二醋键频繁 地修饰成硫代憐酸醋。近几年的临床试验显示，运些硫代憐酸醋保护的核酸除了一些降低 的刺激活性，硫代憐酸醋保护的毒性排除了或严重地限制了运些核酸在任何医药组合物或 药物中的应用。
[0012] 4类已知的具有不同免疫调节型的激活剂中，除了一个所有的成员包含线性DNA 分子。例外公开在EP1196178。该文献公开了短的脱氧核糖核酸分子，完全由天然DNA组 成的包含部分单链的哑铃形的共价闭合序列的包含CG基序的核酸残基（"dSLIM")。根据 EP1196178的公开内容，CG基序位于公开的分子的双链茎两端的单链环中或双链茎中。单 链发卡环保护双链茎远离细胞内部或外部的DNA核酸酶的降解。文献US2009/0053250A1 公开了运样的包含CG基序的哑铃形共价闭合分子与化疗药物的组合。US2007/0049546 A1公开了含有CG基序的哑铃形共价闭合分子共价连接一个或多个取代基。公开出版物 "SchmidtM.等，2006,'CytokineandIg-productionbyCG-containingsequenceswith phosphorodiesterbackboneanddumbbellshape'，Allergy，Vol. 61，pp. 56-63"表明运 样的包含特定CG基序的哑铃形共价闭合分子可能在过敏性疾病的治疗中有用。
[0013] 文献W0 2010/039137公开了免疫调节寡核巧酸括抗剂用于TLR介导的疾病，其在 免疫调苄基序的侧翼序列和/或在寡核巧酸基序中具有一个或多个化学修饰，所述序列是 免疫刺激性，但对于修饰不是。因此，W0 2010/039137公开的寡核巧酸意图抑制TLR引起 的免疫应答。
[0014]W0 2005/042018描述了新的所谓的C类CpG寡核巧酸，其中CpG寡核巧酸的特征 在于，通常位于或接近分子5'或3'末端的CpG序列，和通常位于或接近分子另一末端的 富含GC的回文基序。该文献公开了C类DNA回文序列的差异。 阳01引 上文引用的出版物"A.Krieg，化t.Rev.DrugDisc.，5 :471-484, 2006"公开了不同 类型的CpG寡聚脱氧核糖核巧酸W及它们的效果，但没有公开规避硫代憐酸醋修饰的含有CG基序的哑铃形共价闭合分子。
[0016]W0 2004/000873A2也公开了硫代憐酸醋修饰的含有CG的单链DNA，其可W作为 佐剂添加到融合肤。该文献没有公开含有CG基序的哑铃形共价闭合分子。 阳017]同样地，US 2003/0050263设及在治疗HIV感染的情况下用含有CG的寡核巧酸， 但没有设及在任何序列中含有CG基序的哑铃形的共价闭合分子。
【发明内容】
[0018] 针对现有技术的情况，本发明的目的在于提供可选的具有较高的免疫调节潜力的 免疫调节性DNA构建体，其在转入真核细胞后保持稳定并避免有害的副作用。
[0019] 本发明提供了用作免疫调节剂的DNA构建体，其由DNA残基的部分单链的哑铃形 的共价闭合链组成，所述DNA残基包含两倍的部分杂交的SEQIDNO:1的DNA序列。
[0020] 作为本发明进一步的实施方式，提供了其中单链环包含Ξ个CG基序的构建体。
[0021] 本发明进一步提供了其中每个CG基序两侧连接脱氧胸巧的DM构建体。
[0022] 依照本发明构建体的单链环进一步设想具有至少50%的喀晚含量。该构建体可W 具有脱氧胸巧作为喀晚。
[0023] 作为进一步的实施方式，所述构建体包含至少一个核巧酸，其被选自包含下述基 团的组的官能团修饰：簇基、胺基、酷胺基、醒亚胺基、缩酬基、缩醒基、醋基、酸基、二硫基、 琉基和醒基。
[0024] 此外，所述修饰的核巧酸连接至选自下述组的化合物：包括多肤、蛋白质、碳水化 合物、抗体、脂类、胶束、囊泡、合成分子、聚合物、微弹、金属颗粒、纳米颗粒或固相。
[00巧]本发明的另一个目的是包含上述DNA构建体的药物组合物。药物组合物还可W包 含化学治疗剂。
[00%]本发明的进一步目的是疫苗，其包含上述DNA构建体或包含所述DNA构建体的药 物组合物。进一步设想所述疫苗可W包含本发明的DNA构建体作为佐剂。
[0027] 本发明的另一个目的是根据权利要求1-7任一项的DNA构建体、根据权利要求8 或9的药物组合物或根据权利要求10或11的疫苗在癌症或自身免疫性疾病的治疗中的用 途。
[0028] 同样设想根据权利要求1-7任一项的DNA构建体、根据权利要求8或9的药物组 合物或根据权利要求10或11的疫苗在调节免疫系统中的用途。
【具体实施方式】
[0029] 术语DNA构建体在本发明中的含义不意味着对相应DNA序列的长度的限制。DNA 构建体的单体单位是核巧酸。
[0030] DNA构建体可W人工合成或者部分的或全部的生物来源，其中生物来源包括产生 DNA序列的基于遗传的方法。
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