用于高效率且高通量产生转基因事件的改进的分割种子大豆转化的制作方法

用于高效率且高通量产生转基因事件的改进的分割种子大豆转化的制作方法
【专利说明】用于高效率且高通量产生转基因事件的改进的分割种子大 豆转化
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年12月19日提交的美国临时申请61/739, 349的优先权，兹将 其全文援引并入本申请。
[0003] 对电子提交的序列表的援引
[0004] 序列表的正式拷贝作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web电子提交，文件名为 "73502_ST25.txt"，2013年12月10日生成，大小为19,301字节，并与本说明书同时提交。 该ASCII格式文档中包含的序列表是说明书的一部分，兹将其全部援引并入本申请。
技术领域 阳0化]本公开设及一般意义上的植物育种。提供了用于大豆转化的方法。本公开的方法 可用于转基因大豆的高效率并且高通量的生产，和转基因大豆产品的产业开发。
[0006] 背景 阳007] 大豆（Glycinemax)是最重要的农业作物之一，全世界每年的作物产量超过2亿 公吨，估计价值超过400亿美元。大豆占全球油料种子生产的超过97%。因此，提高运种有 价值的作物的质量和产量的可靠而高效的方法具有显著的利益。
[0008] 用于改良大豆的传统育种方法已经受到限制，因为大部分的大豆栽培种仅源于少 数几个亲本系，导致种质育种基础较窄。化'13如11等，1'18了6〇18:145-151(1990)。现时的 研究工作主要致力于在用植物基因工程技术来提高大豆产量。转基因方法旨在将期望的基 因导入到作物植物的可遗传种系中，W产生优良的植物品系。运种策略已经成功地增加了 其它几种作物植物对疾病、昆虫和除草剂的抗性，同时提高了营养价值。
[0009] 已经开发出了多种用于将基因转移到植物组织中的方法，包括高速微喷射、显微 注射、电穿孔和直接DNA摄取。最近，±壤杆菌介导的基因转化已经被用于将感兴趣的基因 导入到大豆中。然而已经证明，大豆对转基因工程而言是一个具有挑战性的系统。大豆外 植体的高效转化和再生是难W实现的，并且经常难W重复。
[0010] 根癌±壤杆菌是一种致病性的±栖细菌，具有将其DNA(称为T-DNA)转移到宿主 植物细胞内、并诱导宿主细胞产生可用于细菌营养的代谢物的固有能力。使用重组技术，可 W将一些或全部的T-DNA用感兴趣的基因取代，产生可用于转化宿主植物的细菌载体。± 壤杆菌介导的基因转移通常针对组织培养物中未分化的细胞，但也可W针对从植物叶片或 茎获取的已分化细胞。已经开发了多种用于大豆的±壤杆菌介导的转化方法，它们可W根 据被转化的外植体组织松散地分类。
[0011] 美国专利No. 7, 696, 408,0化oft等人公开了一种子叶节k〇t}dedonarynode)方 法，用于转化单子叶植物和双子叶植物。"子叶节"方法设及从5-7日龄大豆幼苗通过在子 叶节的正下方切割除去下胚轴，切开并分离剩余的带有子叶的下胚轴节段，并从子叶除去 上胚轴（epicotyl)。将子叶外植体在蔽芽和/或子叶节的区域中造伤口（wounded)，并与根 癌±壤杆菌在黑暗中培养五天。该方法需要在体外萌发种子，并且制造伤口步骤（wounding step)会引入显著的变数。
[0012] 美国专利No.6, 384, 301，Martinelli等人公开了向来自从大豆种子切下的大豆 胚的活分生组织中进行±壤杆菌介导的基因传递，随后用选择剂和激素培养分生外植体， 并诱导芽形成。与"子叶节"方法相似，优选地在感染之前对分生外植体致伤。
[0013] 美国专利No. 7, 473, 822,Paz等人公开了一种改良的子叶节方法，称作"半种子外 植体"法。使成熟的大豆种子吸胀，表面灭菌，并沿着种厮切开。在感染之前，胚轴和芽被完 全除去，但没有其它的伤口出现。进行±壤杆菌介导的转化，选择潜在转化体，并在选择培 养基上再生外植体。
[0014] 使用运些方法的转化效率仍然相对较低，"子叶节"法在0.3% -2.8%的量级，"分 生外植体"法为1. 2-4. 7% /'半种子外植体"法为3. 2% -8. 7% (整体4. 9% )。本领域的 典型转化效率为大约3%。
[0015] 改良的"分割种子"转基因程序可W加速未来转基因大豆产品的生产和开发。用 于将转基因稳定整合到大豆组织中的高效且高通量的方法将促进育种进程，并具有提高作 物的产量的潜力。
[0016] 公开概要
[0017] 本公开设及转化植物细胞的方法。更具体地，本公开设及用于转化大豆（Glycine max)的方法，其使用±壤杆菌介导转化分割的（split)大豆种子，其中分割的大豆种子保 留一部分胚轴。
[0018] 在一个实施方案中，本公开设及一种产生转基因事件的方法，包括将切割工具插 入大豆种子的种皮W产生第一子叶节段和第二子叶节段，用±壤杆菌接种包括部分胚轴的 该第一子叶节段，所述±壤杆菌包括至少一个转基因，并培养经接种的子叶节段W在经转 化的植物细胞中产生转基因事件。
[0019] 在另一个实施方案中，本公开设及一种产生转基因事件的方法，该方法包括将切 割工具插入大豆种子的种皮W产生包含部分胚轴的子叶节段，用上壤杆菌接种包含该部分 胚轴的子叶节段，所述±壤杆菌包含至少一个转基因，并培养经接种的子叶节段W在经转 化的植物细胞中产生转基因事件，并从该经培养的接种子叶节段产生完整、能育的植物，该 完整、能育的植物包含所述转基因事件。
[0020] 附图简述
[0021] 图1是大豆种子的俯视图。
[0022] 图2是图1的大豆种子的侧视图。
[0023] 图3是图1的大豆种子的沿3-3线截取的剖视图。
[0024] 图4是与图3相似的视图，显示切割工具与大豆种子的部分胚轴的交会。
[0025] 图5是图1的大豆种子的沿5-5线截取的剖视图。显示切割工具顺着大豆的纵轴 插入大豆中。 阳0%] 图6是一对子叶节段的俯视图。
[0027] 图7显示了PDAB9381的质粒图，依照具体的实施方案，该构建体可用于±壤杆菌 介导的大豆外植体的转化。
[0028] 图8显示了PDAB107533的质粒图。
[0029] 图9显示了描绘在不同比例的草甘麟下有至少一半子叶变黄的外植体的百分比 的图。
[0030]图10显示了PDAB105958的质粒图。 阳0川序列表
[0032] 附随的序列表中列举的核酸序列是使用如37C.F.R. § 1. 822定义的核巧酸碱基 的标准字母缩写显示的。仅显示了每个核酸序列的一条链，但是应当理解的是，任何对所显 示的链的提述包括了互补链。在附随的序列表中：
[0033]SEQIDN0:1显示了用于本公开的质粒构建体PDAB9381中的YFP植物转录单元 (PTU)〇
[0034]SEQIDN0:2显示了用于本公开的质粒构建体PDAB9381中的PAT植物转录单元 (PTU)〇
[0035]SEQIDN0:3显示了用于本公开的质粒构建体PDAB107553中的DGT-28植物转录 单元（PTU)。
[0036] 56〇10^:4显示了用于本公开的质粒构建体9〇48107553中的？41'植物转录单元 (PTU)〇
[0037]SEQID^:5显示了用于本公开的质粒构建体口048105958中的册1'植物转录单元 (PTU)〇
[0038] SEQ ID N0:6显示了用于本公开的质粒构建体pDAB105958中的PAT植物转录单元 (PTU)〇
[0039] 发明详述
[0040] 本文公开了用于高效率且高通量地转化大豆的方法。部署所公开的大豆转化方法 所致的转化频率显著高于先前已知的方法，并且可导致高达20. 3%的转化频率。该新型大 豆转化系统的效率是其它方法（即"子叶节"法和"半种子外植体"法）的大约3-8倍，并 可作为提高转基因大豆植物产业开发的基础。
[0041] 一般地，本公开的实施方案设及一种用于转化包含部分胚轴的分割的大豆种子的 新方法。该新型方法是对其它已知转化方法的改良，导致高效产生转基因大豆植物。
[0042] 在一个实施方案中，公开了一种用转基因转化大豆的新方法。本方法的实施方案 包括纵向分割大豆种子获得分割的大豆种子，其中一部分胚轴保持附着在分割的大豆种子 上。接着，使用转化方法用至少一个转基因转化该包含部分胚轴的分割的大豆种子。从被 转化的包含部分胚轴的分割的大豆种子中选择大豆转化体。
[0043] 在本公开的一个实施方案中，在分割大豆种子之前，使大豆种子吸胀（imbibe)。大 豆种子可W吸胀14-16小时。此外，大豆种子可W吸胀其它备选的时长。例如，大豆种子可 W吸胀6, 7,8, 9, 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30， 31，32, 33, ：34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41，42, 43, 44, 45, 46, 47,或 48 小时的时间。
[0044] 在本公开的第二个实施方案中，大豆种子被沿着大豆种子的种厮纵向分割。
[0045] 在一个实施方案中，大豆种子被分割，使得胚轴仍然附着于大豆种子的节端 (nodalend)。大豆种子保留的胚轴可W包括胚轴种子结构的任何部分。运样，在分割的大 豆种子时保留的任何部分或量的胚轴在本公开的范围内。实施方案包括在分割的大豆种子 时保留的胚轴的任何部分，包括胚轴的任何全长部分（化11lengthpodion)或任何非整 体部分（partialportion)。例如，在分割的大豆种子时可保留1/4, 1/3, 1/2, 2/3, 3/4,或 完整的胚轴。
[0046] 在进一步的实施方案中，对保留部分胚轴的分割的大豆种子进行转化，方法是用 携带一个或多个位于构建体内的转基因的根癌±壤杆菌菌株接种该分割的大豆种子。额外 的实施方案可W包括其它的转化方法。例如，高速微喷射介导的转化法、显微注射介导的转 化法、电穿孔介导的转化法、或直接DNA摄取介导的转化方法，或者任何其他的植物转化方 法，被认为在本公开的范围内。
[0047] 在本公开的实施方案中，保留部分胚轴的分割的大豆种子被转化，借此将转基因 导入到大豆细胞内。将转基因导入到大豆细胞内可W产生稳定转化或瞬时转化的大豆植物 细胞。在运一实施方案的一个方面中，一个或多个转基因可W被转化到大豆植物细胞中。在 进一步的实施方案中，转基因包含启动子、开放阅读框、和3'非翻译区。开放阅读框可W编 码基因，其中该基因是标志物基因、农艺基因、或任何其它类型的基因。
[0048] 在一个实施方案中，使用抗微生物选择剂选择被转化的保留部分胚轴的分割的 大豆种子。抗微生物选择剂的实例包括，但不仅限于，草锭麟（glu化sinate)、麟丝菌素、 2, 4-D、卡那霉素、和草甘麟。
[0049] 本公开的实施方案设及从包含部分胚轴的分割的大豆种子再生一个或多个外植 体。外植体的再生通常在选择培养基上进行，但也可W在本领域已知的其他类型培养基中 进行。当成功再生外植体时，可W通过在合适的培养基上进行组织培养（例如"培养"）而 诱导形成一个或多个芽。作为本公开进一步的实施方案，该一个或多个芽可W被培养成完 整、能育的大豆植物。所述芽可包括被转化的胚系细胞（germlinecell)。
[0050] 在本公开随后的实施方案中，完整、能育、成熟的大豆植物可W和另一大豆植物有 性杂交，产生大豆后代植物。在本公开的另一个实施方案中，分离从转化的包含部分胚轴的 分割的大豆种子产生的外植体，并将其推进到细胞-组织培养基中进行芽诱导（2周无选择 和2周有选择）、芽伸长（有选择），和生根（无选择）。推进转基因大豆外植体经过运些 细胞培养阶段后，将产生转基因植物。通过分子分析确认转基因植物含有稳定整合在大豆 基因组中的转基因。然后令特定的转基因大豆植物在溫室中生长至成熟。在实验中，与子 叶法相似，45%的Τι后代被发现具有稳定整合的、可W被遗传给后代大豆植物的转基因拷 贝。该转基因向后代的遗传能力通过使用除草剂LIBERTY?的除草剂筛选和分子分析加W 确认。
[0051] 在另一个实施方案中，本公开设及一种产生转基因事件的方法，包括将切割工具 插入大豆种子的种皮W形成第一子叶节段和第二子叶节段，用±壤杆菌接种包含部分胚轴 的第一子叶节段，所述±壤杆菌包括至少一个转基因，并培养经接种的子叶节段W在经转 化的植物细胞中产生转基因事件。
[0052] 在一个实施方案中，所述方法包括在接种第一子叶节段之前从第一子叶节段和第 二子叶节段除去种皮。在一个进一步的实施方案中，所述方法包括插入切割工具并纵向切 割胚轴W保留部分胚轴与每个子叶节段在一起。在该实施方案的一个方面中，在插入切割 工具之前大豆种子的胚轴有一未切割长度，且第一子叶节段的部分胚轴的长度是该胚轴的 未切割长度的大约1/3至1/2。在该实施方案的另一个方面中，切割第一子叶节段的部分胚 轴W保持部分胚轴附着于第一子叶节段，且保留的部分胚轴的长度是胚轴的未切割长度的 约1/3至1/2。在该实施方案的一个进一步的方面，在插入切割工具之前大豆种子的胚轴具 有一未切割长度，且第一子叶节段的部分胚轴的长度与该未切割长度相等。
[0053] 在另一个实施方案中，插入切割工具包括沿着大豆种子的种厮纵向切割大豆种 子。在该实施方案的一个方面，定位大豆种子外表面上的种厮，并在插入切割工具之前使切 割工具相对于大豆种子定向，W使得切割工具与种厮对齐。在该实施方案的一个进一步的 方面，每个子叶节段包括部分种厮。在该实施方案的另一个方面，大豆种子具有延伸穿过种 厮的纵轴，该纵轴将大豆种子分为第一侧和第二侧。在该实施方案的一个进一步的方面，在 插入切割工具之前握住大豆种子的第一侧。
[0054] 在下面的一个实施方案中，本公开设及在形成第一和第二子叶节段之前插入切割 工具并将切割工具推进大豆种子的胚轴内。在一个替代的实施方案中，形成第一和第二子 叶节段，然后插入切割工具并将切割工具推进大豆种子的胚轴内，产生保留长度为胚轴未 切割长度之分数（例如约1/3至1/2)的部分胚轴的第一子叶节段。 阳化5] 在一个进一步的实施方案中，本公开的方法包括从经培养的接种子叶节段产生完 整、能育的大豆植物，所述完整、能育的大豆植物包括所述转基因事件。在该实施方案的一 个方面，所述完整、能育的大豆植物的转基因事件包括所述转基因事件。在另一个实施方案 中，本主题公开包括产生所述完整、能育的大豆植物的后代，其中该后代植物包括所述转基 因事件，并且任选地，包括从所述后代植物产生大豆种子。
[0056] 在该实施方案的另一个方面，本公开提供所述完整、能育大豆植物的包含所述转 基因事件的后代植物，所述完整、能育大豆植物的后代植物是根据本公开的方法产生的。在 该实施方案的一个进一步的方面，本公开设及从所述后代植物产生的大豆种子，其中所述 大豆种子包含所述转基因事件。在该实施方案的下一个方面，本公开设及通过将所述完整、 能育转基因大豆植物与另一大豆植物杂交来产生大豆植物。在该实施方案的一个进一步的 方面，本公开设及通过从所述完整、能育植物与另一大豆植物的杂交收集后代种子，其中所 述后代种子包含所述转基因事件，来产生后代植物。在该实施方案的另一个方面，本公开设 及通过播种所述后代种子来产生后代植物。在该实施方案的下一个方面，本公开设及通过 从所述后代种子种植后代植物，其中后代植物包含所述转基因事件，来产生后代植物。在该 实施方案的一个进一步的方面，本公开设及通过从较早世代的后代植物产生后续的、较晚 世代的后代植物，使得该后续的后代植物包含所述转基因事件，来产生较晚世代的后代植 物。